植物phasiRNA研究进展（三）

转自植物phasiRNA研究进展（三）

植物phasiRNA (phased, secondary, small interfering RNA) 是一类内源性的、起调控作用的非编码小RNA (sRNA)，它在植物的生长、发育、生殖以及抗病中发挥着重要作用。PhasiRNA 初级转录本由Pol II(RNA polymerase II) 转录，随后miRNA (microRNA) 引导AGO 蛋白对phasiRNA 初级转录本上的靶位点进行剪切，剪切后的phasiRNA 前体片段( 剪切位点的上游或下游片段) 继而被RDR6 (RNA-dependent RNA polymerases 6) 复制成双链RNA，双链RNA 被DCL4 切割成一系列首尾相接，具有一定相位的21-nt 或24-nt的小RNA，即phasiRNA。成熟的phasiRNA 与AGO 蛋白组装成沉默复合体，作用于靶基因，发挥转录后调控的功能。本文对植物phasiRNA 的生物合成通路、生物学功能及其进化进行综述。

植物中phasiRNA的功能

PhasiRNA 在物种进化、植物生长发育、 响应生物和非生物胁迫中都扮演着重要的角色。同时，植物中的phasiRNA 在功能上具有物种特异性，如双子叶植物中的phasiRNA 多参与疾病抵抗，而单子叶植物中的phasiRNA 则多与生殖生长相关。

2.1　调控植物生长发育

PhasiRNA 对于植物的生长发育具有一定的影响。它不仅能够调控植物细胞的分裂和分化，且在不同时期、不同组织中的表达具有一定的差异性，多参与植物的生殖调控。在花发育过程中，无论是21-nt 还是24-nt 的phasiRNA 均在花序中大量表达。单子叶植物和裸子植物雌雄花序中的phasiRNA 多由miR2118 介导产生。玉米和非洲水稻中，花药减数分裂前期，由miR2118 触发产生的21-nt phasiRNA 在花粉囊中累积；而减数分裂期，miR2275 触发产生的24-nt phasiRNA 则聚集于绒毡层和性母细胞中，且该现象会维持到花粉性细胞成熟和单倍体配体分化成花粉。而拟南芥胚珠中，TEX1 通过TAS3-ARF3 通路调控大孢子母细胞的形成，间接影响配子的形成。长日照条件下，PSMS 系水稻中控制光敏雄性核不育基因PMS1 (photopheriod-sensetive genic male sterility 1)的初级转录本能被miR2118 介导切割成21-nt 的phasiRNA，phasiRNA 的累积最终会导致水稻的雄性不育，这对于研究两系不育系的培养很重要。另外，水稻花粉母细胞(pollen mother cells, PMCs)从减数分裂前期过渡到减数分裂期期间，超过700个长链基因间非编码RNA (large intergenic, non-coding RNA, lincRNA) 被由miR2118 介导的MEL1 (MEIOSIS ARRESTED AT LEPTOTENE1) 蛋白剪切，由此生成的21-nt phasiRNA 在大范围减数分裂染色体重组(large-scale meiotic chromosome reprogramming, LMR)过程中，促进同源重组和染色体联会，以表观修饰的方式使减数分裂正常进行。

除了调控植物的生殖发育，phasiRNA 对于植物其他组织的正常发育也有一定的作用。如在蒺藜苜蓿(Medicago truncatula) 叶缘形成过程中，miR390-TAS3-ARF3/ARF4a/ARF4b 通路和植物激素的分布共同影响叶缘的锯齿形态，并间接影响叶片的极性。此外，phasiRNA 可以以移动信号的方式在植物细胞间传递信号，调节植物的生长，如在拟南芥叶原基的近轴位置，由TAS3a 位点生成的21-nt tasiR-ARF 通过细胞间运输从近轴面运动到远轴面，并形成一个梯度分布，从而影响背腹面叶片的极性。除了影响叶片的形态和极性， miR390-TAS3-ARF 通路还能调控植物侧根的生长和发育时间或模式，在大豆中甚至会影响其结节的形成和根瘤菌的感染。

此外，phasiRNA 在植物中还参与其他的代谢调控，如小麦中的miR9678-WSGAR-phasiRNA 通路调控种子的萌发；陆地棉(Gossypium hirsutum)

棉纤维的发育受GhMYB2D 基因位点产生的ta-siRNA 的调控；大亚基核糖体RNA 位点(large subunit rRNA, LSU-rRNA) 产生的phasiRNA 通路与一些核糖体RNA(rRNA) 的生成相关。PhasiRNA与miRNA、内源诱捕靶标(endogenous target mimic,eTM) 共同调节大豆中的脂类合成过程。草莓中的miRFBX7-FBX-phasiRNA 通路在花托中发挥作用并影响其果实的独特性。

2.2　参与胁迫抵制

2.2.1　非生物胁迫

PhasiRNA 参与植物对非生物胁迫的响应，如在水分缺乏的情况下，大豆中的miR1514a 介导剪切NAC 转录因子的转录本产生phasiRNA，以响应干旱胁迫，而毛果杨中也发现47 个phasiRNA参与植物抵抗干旱胁迫的调控，如miR6445-PHA18通路产生的phasiRNA 调控毛果杨的干旱耐受性。除了响应干旱胁迫，毛果杨中的miR393-PHA1/2 通路产生的phasiRNA 能够负调控PHA1 和PHA2 基因以应对盐胁迫。TAS1-HTT1(HEAT-INDUCEDTAS1 TARGET1)/HTT2 调控植物的耐热性，而在缺磷、糖、脱落酸(ABA) 等诱导下，miR828-TAS4-siR81(-) 正调控MYB 转录因子，如PAP1、PAP2 和MYB113 以促进植物中花青素的合成[38,67-69]，累积的花青素可以清除植物细胞在胁迫下产生的自由基。

2.2.2　生物胁迫

除了应对非生物胁迫，phasiRNA 也参与植物对生物胁迫的响应。植物中抵御病毒入侵的基因主要是R基因(resistance gene)，它包括NB-LRR (nucleotide binding leucine-rich repeat) 基因、RLK (receptor likekinases) 基因、RLP (receptor like protein) 基因等。

R 基因中存在多个PHAS 位点，且产生的phasiRNA也多数靶向R 基因，以应对病菌的入侵，如在苜蓿属中发现的能够产生phasiRNA 的114 个位点中绝大多数都与NB-LRR 编码基因相关。据相关文献报道，抵御病菌入侵的miR482/miR2118-NB-LRR通路普遍存在于单子叶、双子叶和裸子植物中，如大豆和苜蓿中，miR2118 触发TIR-NBS-LRR (Toll/interleukin 1 receptor nucleotide binding site-leucinerich repeat) 基因位点产生phasiRNA 以抵御病原体入侵，而在拟南芥和水稻的TIR-NBS-LRR 基因上也发现类似的靶位点。另外，植物的TIR-NBLRR基因在不同组织中产生不同的phasiRNA，以抵御不同的病原体入侵。豆类中的miR390-TAS3通路产生ta-siRNAs 抑制植物激素转录因子ARF2/3/4的表达，以增强激素信号转导的方式抵御根瘤菌的感染。而phasiRNA 的反式作用能够帮助西红柿抵御马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd) 的感染。

植物中phasiRNA的进化

植物中的phasiRNA 以及它的合成通路有些随着物种进化而进化，有些则比较保守。真双子叶植物中普遍存在的3 个编码蛋白的PHAS 基因家族，分别为NB-LRRs、PPRs 和MYBs，而单子叶植物中的phasiRNA 前体主要是非编码RNA。TAS3 基因在单子叶植物和双子叶植物中发生了进化，如TAS3-2 基因家族在苹果等其他双子叶物种中普遍存在，而在拟南芥中却没有发现该基因，但是它产生的phasiRNA 所靶向的ARF 基因与拟南芥的ARF 基因同源。TAS4 也随着单子叶植物和双子叶植物的分歧发生了进化，只出现在双子叶植物中。

植物中PHAS 网络是动态的，phasiRNA 合成通路中的miRNA 作为该通路的关键因子，既有延续其最初功能的，也有随着物种的进化做出相应改变的。根据分析，不同植物间的同种miRNA 的靶基因相同，具有一定的保守性，如拟南芥、苹果等植物中的miR390-TAS3-ARF3/ARF4 通路，拟南芥、豆科中的miR393-TIR1/AFB 通路，云杉、西红柿中的miR482/miR2118-NB-LRR 通路和云杉、马铃薯番茄中的miR4376-ACA10 通路( 表1)均呈现这种物种间的保守性。有些miRNA 在植物中有多个靶基因，并在植物的不同生长阶段触发产生不同的phasiRNA 以满足植物的不同生长需求( 表2)。而在物种进化过程中，各类植物的需求不同，同种miRNA 的靶基因也出现分歧，如真双子叶植物中的miR482/miR2118 靶向NB-LRR 基因，禾本科植物生殖细胞中的miR482/miR2118 则靶向非编码PHAS 位点， 而miR482/miR2118 介导的这两种phasiRNA 产生通路在裸子植物中同时存在。另外，触发产生phasiRNA 的miRNA 在各类植物间也具有一定的差异性， 如棉花中的miR828 和miR858 都可以靶向MYB 基因的初级转录本，而苹果中MYB 基因的初级转录本除了可以由这两个miRNA 触发产生phasiRNA 外，还可以由miR159触发产生( 表3)。

植物在切换发育模式或应对环境刺激时，phasiRNA 将通过时空表达的变化来帮助植物应对发育或环境的变化，如大豆叶片和根部在应对不同病原体入侵时会产生不同的phasiRNA。PhasiRNA的种类随着物种的进化也有不同，如野生大豆与驯化大豆在phasiRNA 的种类和数目上存在差异；各类植物中的phasiRNA 片段长度也不尽相同，21-nt 的phasiRNA 在很多植物中都存在，而24-nt的phasiRNA 只在单子叶植物中有发现，但有研究表明，双子叶植物中也发现了产生24-nt phasiRNA的PHAS 位点。

此外，phasiRNA 的靶基因也随着植物的进化而出现变更，如TAS3 产生的ta-siRNA 在不同种类的植物中靶标基因并不完全相同，苔类植物中ta-siRNAs 靶定AP2 基因，而在藓类植物中ta-siRNA靶定AP2 和ARF (auxin responsive factor) 基因，而近代植物中ta-siRNA 只靶向ARF 基因。

结语

植物细胞中多种因子的协同调节是保证植物正常生长发育的必备条件。PhasiRNA 作为小RNA 的一员，广泛存在于各类植物以及它们的各种组织中，并参与调控植物的生命活动。目前pre-phasiRNA在细胞中加工成成熟的phasiRNA 的机制尚未清楚，但有研究表明，在顺式高尔基体上发现SGS3 和AGO7 的存在，而高尔基体的功能是加工、分类和包装内质网上合成的蛋白，所以phasiRNA 的后续生成可能是在高尔基体上进行的。此外，phasiRNA需要miRNA 的介导才能产生，且其在组织中的移动能力比miRNA 强， 猜测phasiRNA 是一种在特殊情况下，如生殖期间或病毒入侵，迅速全方位调控植物生命活动的siRNA。植物体内phasiRNA 的表达量也会影响植物的生长发育，有的甚至导致植物的死亡，所以植物体内的phasiRNA 必须处于合适的水平。研究植物中众多phasiRNA 的合成通路以及它们调控靶基因表达的机制，有助于我们深入了解植物生长发育的调控网络，对于通过表观遗传途径改变农作物的性状从而获得理想的农作物也具有指导意义。

参考文献

[1] Zhai J, Jeong DH, De Paoli E, et al. MicroRNAs as master regulators of the plant NB-LRR defense gene family via the production of phased, trans-acting siRNAs. Genes Dev, 2011, 25: 2540-53

[2] Zhang C, Li G, Wang J, et al. Identification of trans-acting siRNAs and their regulatory cascades in grapevine. Bioinformatics, 2012, 28: 2561-8

[3] Dukowic-Schulze S, Sundararajan A, Ramaraj T, et al. Novel meiotic miRNAs and indications for a role of phasiRNAs in meiosis. Front Plant Sci, 2016, 7: 762

[4] Komiya R. Biogenesis of diverse plant phasiRNAs involves an miRNA-trigger and Dicer-processing. J Plant Res, 2017,130: 17-23

[5] Wu F, Chen Y, Tian X, et al. Genome-wide identification and characterization of phased small interfering RNA genes in response to Botrytis cinerea infection in Solanum lycopersicum. Sci Rep, 2017, 7: 3019

[6] Zheng Y, Wang S, Sunkar R. Genome-wide discovery and analysis of phased small interfering RNAs in Chinese sacred lotus. PLoS One, 2014, 9: e113790

[7] Shuai P, Su Y, Liang D, et al. Identification of phasiRNAs and their drought-responsiveness in Populus trichocarpa.FEBS Lett, 2016, 590: 3616-27

[8] Guan X, Pang M, Nah G, et al. miR828 and miR858 regulate homoeologous MYB2 gene functions in Arabidopsis trichome and cotton fibre development. Nat Commun, 2014, 5: 3050

[9] Fan Y, Yang J, Mathioni SM, et al. PMS1T, producing phased small-interfering RNAs, regulates photoperiodsensitive male sterility in rice. Proc Natl Acad Sci USA,2016, 113: 15144-9

[10] Zheng Y, Wang Y, Wu J, et al. A dynamic evolutionary and functional landscape of plant phased small interfering RNAs. BMC Biol, 2015, 13: 32

[11] Yu Y, Zhou Y, Zhang Y, et al. Grass phasiRNAs and malefertility. Sci China Life Sci, 2018, 61: 148-54

[12] Komiya R, Ohyanagi H, Niihama M, et al. Rice germlinespecific Argonaute MEL1 protein binds to phasiRNAs generated from more than 700 lincRNAs. Plant J, 2014,78: 385-97

[13] Johnson C, Kasprzewska A, Tennessen K, et al. Clusters and superclusters of phased small RNAs in the developing inflorescence of rice. Genome Res, 2009, 19: 1429-40

[14] Vogel JP, Garvin DF, Mockler TC, et al. Genome sequencing and analysis of the model grass Brachypodium distachyon. Nature, 2010, 463: 763-8

[15] Ta KN, Sabot F, Adam H, et al. miR2118-triggered phased siRNAs are differentially expressed during the panicle development of wild and domesticated African rice species. Rice: NY, 2016, 9: 10

[16] Xia R, Xu J, Arikit S, et al. Extensive families of miRNAs and PHAS loci in Norway spruce demonstrate the origins of complex phasiRNA networks in seed plants. Mol Biol Evol, 2015, 32: 2905-18

[17] Zhai J, Zhang H, Arikit S, et al. Spatiotemporally dynamic,cell-type-dependent premeiotic and meiotic phasiRNAs in maize anthers. Proc Natl Acad Sci USA, 2015, 112: 3146-51

[18] Su Z, Zhao L, Zhao Y, et al. The THO complex non-cellatonomously represses female germline specification through the TAS3-ARF3 module. Curr Biol, 2017, 27:1597-609.e2

[19] Liu H, Nonomura KI. A wide reprogramming of histone H3 modifications during male meiosis I in rice is dependent on the argonaute protein mel1. J Cell Sci, 2016, 129: 3553-61

[20] Nonomura K, Morohoshi A, Nakano M, et al. A germ cell specific gene of the argonaute family is essential for the progression of premeiotic mitosis and meiosis during sporogenesis in rice. Plant Cell, 2007, 19: 2583-94

[21] Zhou C, Han L, Fu C, et al. The trans-acting short interfering RNA3 pathway and no apical meriste antagonistically regulate leaf margin development and lateral organ separation, as revealed by analysis of an argonaute7/lobed leaflet1 mutant in Medicago truncatula. Plant Cell, 2013, 25:4845-62

[22] Benkovics AH, Timmermans MC. Developmental patterning by gradients of mobile small RNAs. Curr Opin Genet Dev,2014, 27: 83-91

[23] de Felippes FF, Ott F, Weigel D. Comparative analysis of non-autonomous effects of tasiRNAs and miRNAs in Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Res, 2011, 39: 2880-9

[24] Fukushima K, Hasebe M. Adaxial-abaxial polarity: the developmental basis of leaf shape diversity. Genesis, 2014,52: 1-18

[25] Jagadeeswaran G, Zheng Y, Li YF, et al. Cloning and characterization of small RNAs from Medicago truncatula reveals four novel legume-specific microRNA families.New Phytol, 2009, 184: 85-98

[26] Husbands AY, Chitwood DH, Plavskin Y, et al. Signals and prepatterns: new insights into organ polarity in plants.Genes Dev, 2009, 23: 1986-97

[27] Adenot X, Elmayan T, Lauressergues D, et al. DRB4-dependent TAS3 trans-acting siRNAs control leaf morphology through AGO7. Curr Biol, 2006, 16: 927-32

[28] Hobecker KV, Reynoso MA, Bustos-Sanmamed P, et al.The microRNA390/TAS3 pathway mediates symbiotic nodulation and lateral root growth. Plant Physiol, 2017,174: 2469-86

[29] Fahlgren N, Montgomery TA, Howell MD, et al. Regulation of AUXIN RESPONSE FACTOR3 by TAS3 ta-siRNA affects developmental timing and patterning in Arabidopsis. Curr Biol, 2006, 16: 939-44

[30] Guo G, Liu X, Sun F, et al. Wheat miR9678 affects seed germination by generating phased siRNAs and modulating abscisic acid/gibberellin signaling. Plant Cell, 2018, 30:796-814

[31] Ye CY, Xu H, Shen E, et al. Genome-wide identification of non-coding RNAs interacted with microRNAs in soybean. Front Plant Sci, 2014, 5: 743

[32] Xia R, Ye S, Liu Z, et al. Novel and recently evolved microRNAclusters regulate expansive F-BOX gene networks through phased small interfering RNAs in wild diploid strawberry. Plant Physiol, 2015, 169: 594-610

[33] Sosa-Valencia G, Romero-Perez PS, Palomar VM, et al. Insights into the function of the phasiRNA-triggering miR1514 in response to stress in legumes. Plant Signal Behav, 2017, 12: e1284724

[34] Sosa-Valencia G, Palomar M, Covarrubias AA, et al. The legume miR1514a modulates a NAC tranion factor tran to trigger phasiRNA formation in response to drought. J Exp Bot, 2017, 68: 2013-26

[35] Li S, Liu J, Liu Z, et al. HEAT-INDUCED TAS1 TARGET1 mediates thermotolerance via HEAT STRESS TRANION FACTOR a1a-directed pathways in Arabidopsis. Plant Cell, 2014, 26: 1764-80

[36] Hsieh LC, Lin SI, Shih AC, et al. Uncovering small RNAmediated responses to phosphate deficiency in Arabidopsis by deep sequencing. Plant Physiol, 2009, 151: 2120-32

[37] Xia R, Zhu H, An YQ, et al. Apple miRNAs and tasiRNAs with novel regulatory networks. Genome Biol, 2012, 13:R47

[38] Luo QJ, Mittal A, Jia F, et al. An autoregulatory feedback loop involving PAP1 and TAS4 in response to sugars in Arabidopsis. Plant Mol Biol, 2012, 80: 117-29

[39] Shi MZ, Xie DY. Biosynthesis and metabolic engineering of anthocyanins in Arabidopsis thaliana. Recent Pat Biotechnol, 2014, 8: 47-60

[40] Sekhwal MK, Li P, Lam I, et al. Disease resistance gene analogs (RGAs) in plants. Int J Mol Sci, 2015, 16: 19248-90

[41] Shivaprasad PV, Chen HM, Patel K, et al. A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs. Plant Cell, 2012, 24: 859-74

[42] Li F, Pignatta D, Bendix C, et al. MicroRNA regulation of plant innate immune receptors. Proc Natl Acad Sci USA,2012, 109: 1790-5

[43] Sun Y, Mui Z, Liu X, et al. Comparison of small RNA profiles of glycine max and glycine soja at early developmental stages.Int J Mol Sci, 2016, 17: 2043

[44] Zheng Y, Wang Y, Ding B, et al. Comprehensive tranome analyses reveal that potato spindle tuber viroid triggers genome-wide changes in alternative splicing,inducible trans-acting activity of phased secondary small interfering RNAs, and immune responses. J Virol, 2017, 91:e00247-17

[45] Shen D, Wang S, Chen H, et al. Molecular phylogeny of miR390-guided trans-acting siRNA genes (TAS3) in the grass family. Plant Syst Evol, 2009, 283: 125-32

[46] Allen E, Xie ZX, Gustafson AM, et al. microRNAdirected phasing during trans-acting siRNA biogenesis in plants. Cell, 2005, 121: 207-21