CRISPR和TP53文献解读之:Cas9诱导P53激活并导致细胞死亡

前期文章:

  1. 我们用两篇文章的篇幅大概讲了一遍质粒骨架及其各个要素的介绍:
    解剖式学习一个质粒结构--update
    质粒系列之什么是质粒
  2. 再谈了最传统的限制性克隆
    质粒系列之限制性克隆--restriction cloning
  3. 前面还夹杂的讲过一些piggybac、gateway、RMCE的一些内容:
    基因编辑如何换药不换汤
  4. 慢病毒系列也有讲过两篇:
    团队作案HEK293,史上最强搬砖细胞
    不想再用慢病毒了,我还有什么别的选择吗?piggyBac transposon
  5. 此外我们本还有一个CRISPR screening的专题,只有开头,未得完善:精准大海捞针--5. CRISPR screening专题
  6. 质粒系列之再谈无缝连接--Gibson assembly
  7. Golden Gate,质粒改造的王者
  8. 关于CRISPR-Cas9技术的脱靶效应:CRISPR-Cas9基因编辑--脱靶效应如何检测

在将CRISPR脱靶效应时,我们在文末提到CRISPR编辑效率与P53状态之间的关系,同时Cas9稳定表达可能会对细胞造成影响,从而增加CRISPR-Cas9的应用风险。不禁会有疑问:为何要将CRISPR与P53联系在一起?

1. DNA损伤和P53 response

我们首先要了解DNA损伤与P53之间的关系,如下图:

DNA damage and P53 response

由上图可见:

左上角:电离辐射(IR)等引起的DNA双链断裂(DSB),可经由ATM信号从而激活P53;

右上角:UV等引起的DNA单链断裂或损伤,可经由ATR信号,激活P53。

可见几乎任何一种DNA损伤都会导向至P53反应。而我们不止一次强调,CRISPR-Cas9的上半部分是引起DNA双链断裂(DSB),之后通过不同的修复方式达到精准基因编辑(HDR,MMEJ)或移码突变(NHEJ)。于是,CRISPR作为一种可造成DNA”损伤“的技术,该技术的应用不可避免的引起P53反应。

但,P53反应和CRISPR技术应用隐患有何关系?

2. P53的功能

接着,我们可以简单来看看P53在生命体中到底有何作用。

抑癌基因:TP53(tumor suppressor protein)可以说只知名程度最高的抑癌基因之一(甚至可以说是第一)。在大部分肿瘤中都可检测到TP53突变,同时肿瘤细胞又常常表现出基因组紊乱的现象。因此,人们推测TP53的突变与肿瘤发生有关。随后有大量的动物实验和临床研究表明,TP53在体细胞突变引起的肿瘤中高度突变,同时germline TP53突变的病人也常会罹患一种甚至多种肿瘤疾病。

基因卫士:TP53作为DNA损伤的反应机制,在正常情况下P53蛋白由于MDM2的泛素化从而被快速降解,因此属于不稳定状态。而当DNA损伤出现时,MDM2被磷酸化从而失去泛素化P53的功能,P53的表达迅速增加。而P53作为一种转录因子,迅速调控下游的各项指标。当DNA损伤较轻时,P53会介导细胞周期阻滞,从而给予细胞DNA修复的机会,经过修复后的细胞可再次进入细胞周期。而当DNA损伤十分严重无法修饰时,P53会将引导细胞走向凋亡,从而避免不良DNA损伤传递给子代。因而,TP53因其维持基因组稳定性的作用,达到抑癌的效果。

其他:P53的内容十分繁多,如P53在肿瘤中的变化大多是错义突变而非缺失,突变的部分大多在DNA binding domain,导致P53功能缺失的突变我们叫“loss of function, LOF”。而有一部分P53突变会产生突变体,该突变体不仅抑制剩余的野生型的P53的功能,同时自身还拥有新的功能,此时我们称之为“gain of function, GOF”,这时候的P53突变体可被称为oncogene。此外,如P53不仅仅在肿瘤细胞中有突变,其实在正常体细胞中也常检测到突变,有前两年有一篇文章详细介绍了这部分内容,并提出紫外线等是P53突变的主要原因之一,所以小伙伴们,防晒搞起来噻!

综上所述,P53作为一个维持人体基因组稳定性的重要基因,如果CRISPR技术打断了TP53的功能,那么其后果将相当严重

3. 文献解读:P53抑制CRISPR-Cas9编辑

第一篇文章发便于2018年七月份的Nature Medicine,从标题上很明显看出内容为,P53可抑制CRISPR-Caas9在人多功能干细胞上的应用。

paper 1

1. 背景和科学问题:起初人们发现在干细胞上进行基因编辑的效率总是很低。

2. 目的和解决办法:为了提高CRISPR编辑效率,作者通过以下两种方式达成高达80%的基因编辑效率:

(1) 构建Cas9稳定表达的人多功能干细胞(human pluripotent stem cell,hPSC)

如下图所示,作者将一个双Tet-On 3G的Cas9及其筛选标记元件插入到AAVS1位点,改系统可控制Cas9表达的时间。同时sgRNA投放方式为慢病毒稳转。

Tet-On 3G

(2) 瞬转Cas9-ribonucleoproteins (RNPs)

当作者提高基因编辑效率后,发现有不少人多功能干细胞在基因编辑后死亡,这就引起了作者的好奇:缘何死亡,机制为何?因此他们设计了以下实验并最终找到了原因。

3. 实验设计和主要结果

3.1 CRISPR-Cas9可导致人多功能干细胞(hPSC)死亡

在以往研究中,由于基因编辑效率很低,因此没有观测到CRISPR明显的细胞毒性。而当作者将编辑效率增加至80%以上以后,观测到了明显的细胞毒性现象。如下图所示,(e)在图e中,通过四环素诱导Cas9表达,并结合sgRNA对MAPT基因进行编辑MAPT基因并不是人多能干细胞生存所必须的基因,换言之,敲除该基因不应该对细胞的生存造成影响。而结果却显示,对MAPT基因编辑的同时,细胞团块缩小,证明有大量细胞死亡(h)在图h中,一样观测到了类似的现象。当然还有很多其他证据支持,最终文章的结论为,CRISPR-Cas9基因编辑会导致hPSC细胞的死亡。那么CRISPR-Cas9基因编辑导致细胞死亡的原因到底为何?

design

3.2 CRISPR-Cas9诱导人多功能干细胞(hPSC)死亡与Cas9造成的DSB相关

为了验证CRISPR-Cas9诱导人多功能干细胞(hPSC)与Cas9诱导的DSB之间的no bias关系,而非特定基因编辑导致的死亡。作者对hPSC进行CRISPR文库筛选,通过查看CRISPR文库内的sgRNA分布变化查看CRISPR-Cas9与hPSC死亡的关系。

注意:下图中出现的ddCas9是Cas9的一种变体,当没有Shield1的时候,ddCas9蛋白降解,无法行使其功能,只有在Shield1存在时ddCas9才能稳定行使功能。

如下图c-d所示:1)在没有基因编辑发生的H1,iCas9+Dox组中,无论是target到目的基因的sgRNA还是没有target gene的sgRNA,在12天的筛选之后都没有出现sgRNA分布的差异(2)当外加Dox诱导Cas9表达,或者外加Shield1诱导ddCas9稳定之后,CRISPR-Cas9基因编辑的发生导致了有target的sgRNA分布出现了差异,证明有 一部分targeting sgRNA转染细胞已经在基因编辑过程中死亡。同时non-targeting sgRNA比例的增加,反向证实了一部分targeting sgRNA转染细胞的消失。以上结果证明了全基因组性的基因编辑导致细胞死亡,其原因可能是Cas9导致的基因毒性,而非特定的基因缺失导致的死亡。

而图e结果表示,这种对于CRISPR-Cas9毒性的敏感性主要表现在干细胞中,而常见的工具细胞和肿瘤细胞并没有这种现象。

design2
stem cell are more sensitive to CRISPR-Cas9 induce cytotoxicity

3.3 P53参与 CRISPR-Cas9诱导人多功能干细胞(hPSC)死亡过程

以上结果虽证实了CRISPR-Cas9编辑过程造成hPSC死亡的因果关系,但没办法把P53牵扯进来。思路很简单,就把前面做的MAPT gene editing的细胞送RNA-seq,看一下差异基因(左图a)。差异基因自然有许多,但P21作为P53的下游赫然在列,而且变化倍数非常大。当然为了排除MAPT基因的影响,还对其他基因编辑细胞进行了P21表达鉴定(右图d-g),进一步证实P21的变化,而P53作为P21的直接上游,应也是参与了这个过程。

p21 change

3.4 P53突变可逆转CRISPR-Cas9 induce DSB导致的hPSC死亡

上述所有结果都只是证明了P53与CRISPR-Cas9诱导的hPSC死亡相关,但还是不能证明P53是hPSC在CRISPR-Cas9基因编辑过程中死亡的原因。因此作者构建了一个P53 mutant pool,这个pool中有一半以下是P53WT的细胞,一半以上是P53 mutant的细胞。可以看到左图(c)中显示:(1)在control pool中激活CRISPR-Cas9基因编辑,细胞的融合度不断下降,证明有细胞死亡;(2)而在P53 mutant pool中,CRISPR-Cas9的激活,虽相对未激活组(P53 mutant pool -Dox),其融合度有所下降,但融合度相对 control+Dox组有所上调。我们分析可知,融合度下降的原因在于P53WT细胞的死亡,而融合度上升则在于P53 mutant细胞的死亡抵抗右图(e)中通过外加P53DD抑制野生型P53功能,细胞团块得到生长。

P53 involved

以上结果均表明,在P53功能失活之后,CRISPR-Cas9介导的死亡被抑制,因此证明了P53是CRISPR-Cas9介导hPSC死亡的原因。

4. 小结

作者切入点看起来很简单,但却也很巧妙。CRISPR-Cas9作为诱导DSB的因素,常理来说一定会诱导P53的激活,而P53激活则会介导下游相关功能的体现(细胞周期阻滞、细胞衰老甚至死亡),这是一个很清晰明了的思路,但我们很多人都没有想过。且据我们经验,人多功能干细胞常规的P53-P21表达水平非常低,WB和免疫荧光几乎无法检测到。但该类细胞对外界刺激非常敏感,如人胚胎干细胞只需要给予1-2 Gy的X光即可造成死亡。而成纤维细胞、间充质干细胞或者肿瘤细胞,给予10-30 Gy X光还无动于衷。由此可见,人多功能干细胞对DSB激活P53更为敏感,更易死亡。正是因为这种敏感的机制,才能使得人多功能干细胞的基因组一直比别的细胞更为稳定。虽然人多功能干细胞更为敏感,但不代表这种机制在其他常见细胞中不会发生。

由于P53 WT细胞可应对CRISPR-Cas9诱导的DSB,更易死亡,而P53 mutant细胞可以抵抗.。因此CRISPR-Cas9则成为了一个P53 mutant细胞的筛选因子,长此以往,细胞群落中P53 mutant的比例越来越高,其风险不言而喻。

这篇文章我在19年初就已读过,以为文章解读会写得比较容易,但当提笔写的时候发现有很多细节当时根本没有注意。比如这篇文章纯熟的运用了CRISPR技术的多种手段,从普通敲除到inducible knockout,而且它的inducible还有多种方式(Cas9的诱导表达,Cas9的诱导稳定以及Cas9的诱导失活);从单个基因的验证到全基因组的文库筛选。因此我觉得这篇文章不仅仅是阐明CRISPR技术的应用风险一篇重要文章,同时也是我们全面学习CIRSPR技术的良好案例。文章非常棒, 值得回到原文好好细读。

本来这次推文还想解读两篇文献,考虑到篇幅只能将另一篇文献放在下一篇文章中了。写的时候还担心写简单了不够深入、写复杂了太过枯燥,内容是一展再展又一删再删。希望经过整修之后,内容不那么枯燥,还能有所帮助,感谢阅读并期回馈交流~

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