m6A writer与癌症进展的关系的探究有助于开发新的治疗策略

Downregulation of m6A writer complex member METTL14 in bladder urothelial carcinoma suppresses tumor aggressiveness

膀胱尿路上皮癌中m6A writer复合物成员METTL14的下调抑制肿瘤侵袭性

发表期刊：Mol Oncol

发表日期： 2022 Jan 19

doi:10.1002/1878-0261.13181

期刊相关信息

一、背景

        膀胱癌（BlCa）是全球第十大发病癌症，是癌症死亡的第十四大原因。BlCa被进一步分为两大类，具有独特的病理和临床意义：非肌层浸润性BlCa（NMIBC）和肌层浸润性BlCa（MIBC）。

        表观基因组学是指对影响RNA分子的可逆化学修饰的研究，包括mRNA和非编码RNA。N6-甲基腺苷（m6A，即腺苷碱在氮-6位的甲基化）是真核生物中最丰富的mRNA内部化学修饰。m6A在终止密码子附近，在3'-UTR处和长内部外显子内特异性富集，从而影响mRNA寿命的不同步骤，例如转录，剪接，核输出和翻译。这种修饰是由m6A甲基转移酶复合物-MTC（"writers"）催化的，它由甲基转移酶样3和14蛋白（METTL3和METTL14）及其辅助因子（Wilms 肿瘤相关蛋白 (WTAP)、Virilizer (KIAA1429/VIRMA)、RNA 结合基序蛋白 15/15B (RBM15/15B) 和锌指 CCCH 结构域蛋白 13（HAKAI 和 ZC3H13））组成。m6A也可以通过 m6A去甲基化酶（“橡皮擦”）去除，包括人类肥胖相关蛋白 (FTO) 和 AlkB 同源物 5 (ALKBH5)。此外，还有一些直接与 m6A 结合并介导其功能的蛋白质，称为“阅读器”，包括 YTH 结构域家族和HNRNPA2B1或IGF2BP蛋白质家族。值得注意的是，一些研究表明m6A和相关的调节蛋白与一些癌症有关。

二、材料与方法

1.数据来源

(1）肿瘤样本：120份（60份NMIBC和60份MIBC）福尔马林固定和石蜡包埋未经治疗的组织；40份正常尿道粘膜（NUT）的组织样本，来源于肾细胞肿瘤（肾细胞癌或肿瘤细胞瘤）患者的肾切除标本，没有UC病史

(2）细胞系：七个膀胱癌细胞系（MGHU3, RT112, 5637, J82, T24, UMUC3, TCCSUP）和一个来自ATCC的正常膀胱细胞系SV-HUC1用于m6A调节因子的蛋白质表征

2.实验流程

(1）数据分析：访问在线平台cBio-Portal，评估BlCa组织中m6A“writer”和“橡皮擦”的差异表达，以确定哪个亚单位可能在BlCa中发挥m6A脱控的关键作用；GEPIA用于分析TCGA和GTEx项目的膀胱肿瘤和正常样本的RNA测序表达数据

(2）实验：免疫组化、膀胱癌细胞系和细胞培养、蛋白质的提取和定量、蛋白质印迹（WB）分析、免疫荧光分析、RNA甲基化定量分析、CRISPR-Cas9介导的METTL14的敲除、点状印迹、细胞存活率测定、细胞凋亡试验、伤口愈合试验、侵袭试验、邻近连接试验、绒毛膜试验

三、实验结果

01 - 膀胱癌中m6A甲基化酶和去甲基化酶的计算机分析

        TCGA数据库可在cBioPortal进行分析，包括413名MIBC患者的肿瘤样本。74%为男性，而26%为女性，诊断时的中位年龄为61岁。对编码m6A调节蛋白的基因组区域的计算机分析显示，56%的MIBC患者有不同的分子改变（图1A）。在所有查询到的 m6A 调节蛋白中，VIRMA 是最常改变的基因（30%的样本），经常被扩增或有表达高mRNA水平。接下来，使用GEPIA服务器，分析了同一组样本与非癌组织的表达水平比较。与正常膀胱组织相比，METTL14 mRNA的表达是所分析的样本中唯一明显下调的m6A调节蛋白（图1B）。

图1 计算机分析

02 - BlCa组织中m6A和m6A调节因子蛋白的免疫表达情况

        由于没有NMIBC的可用数据并且缺乏MIBC的验证，因此在葡萄牙波尔图肿瘤研究所（IPO Porto）诊断和治疗的膀胱癌患者的不同和独立的组织中进一步评估m6A。对所有测试的蛋白质都观察到了核表达。图2A中描述了免疫染色模式的例子。总的来说，METTL3、METTL14、VIRMA和ALKBH5的免疫表达水平在肿瘤和正常组织之间有明显差异。具体来说，METTL3、METTL14、ALKBH5和VIRMA（图2A）在BlCa中的表达明显低于正常组织。此外，METTL3和METTL14（异源催化核心）在MIBC中的表达水平与NMIBC相比明显较低。然而，在三个组织样本中，m6A、WTAP和FTO的免疫染色没有明显的差异。

        所有研究的writer的表达与肿瘤样本中的m6A丰度呈正相关。除FTO外，在“橡皮擦”的表达方面也观察到同样的情况。有趣的是，除了WTAP和两个“橡皮擦”外，大多数m6A writer和“橡皮擦”的表达之间也有相关性，VIRMA和FTO之间也有相关性。 没有发现任何测试的蛋白质的表达与病人的吸烟习惯、性别或诊断时的年龄有统计学意义上的差异。尽管如此，在METTL3的表达和病理阶段之间发现了一个重要的关联。事实上，METTL3的表达在晚期疾病中明显减少（图2B）。

图2 组织样本中的IHC

03 - 细胞系中m6A和调节蛋白的细胞定位和定量分析

        m6A调节蛋白的表达在测试的细胞系中存在明显差异（图3A）。具体而言，与良性细胞系相比，BlCa 细胞系揭示了 METTL14 writer 的异质水平。在BlCa细胞系中，UMUC3显示了METTL14的高相对表达。总的来说，在所有的细胞系中，所有的“writer”和“橡皮擦”都分别定位在细胞核和细胞质中（图3B），这与使用IHC在原发肿瘤中的观察结果一致。从整体上看，BlCa细胞与正常细胞相比表现出更高的m6A水平，尽管没有发现统计学上的显著差异。在5637和UMUC3细胞中观察到最高水平，大约是良性细胞系的两倍（图3C）。

图3 膀胱癌细胞系的特征

04 - METTL14在UMUC3中的敲除：体外实验

        虽然METTL3是研究最多的催化亚基，但METTL14作为m6A甲基转移酶的“writers ”之一，也积极参与肿瘤的发生。由于UMUC3细胞系显示了METTL14的相对高表达量，而且它代表了浸润性尿路上皮癌，这是一种侵袭性的疾病形式，作者决定在这个特定的细胞系中对这个角色进行敲除。通过CRISPR-Cas9系统，METTL14-KD 在 UMUC3 中通过 CRISPR-Cas9 系统有效完成，蛋白质水平降低了约 55%（图 4A），同时总 m6A 水平降低（图 4B）。

图4 METTL14敲除UMUC3细胞

        METTL14-KD UMUC3细胞在24小时内显示出明显的细胞凋亡（约3倍）（图4C），而在两个不同的测试时间点上没有观察到细胞活力的明显差异（图4D）。此外，METTL14-KD UMUC3 细胞的迁移（24 h，P < 0.001）（图 4E）和细胞侵袭能力（24 h，P = 0.0006）（图 4F）显著降低。值得注意的是，与加扰相比，METTL14-KD UMUC3细胞中METTL14和METTL3之间的相互作用明显减少（图4G）。

05 - METTL14在UMUC3中的敲除：体内试验

        为了进一步了解METTL14在BlCa肿瘤生长中发挥的作用，作者进行了CAM试验。与加扰状态相比，METTL14-KD细胞产生的肿瘤明显较小（图5A，B）。此外，METTL14-KD细胞在肿瘤外围的血管数量较少，即使在肿瘤大小正常化的情况下也是如此（图5C）。

图5    在UMUC3体内敲除METTL14

四、结论

        总的来说，m6a调控蛋白在BlCa中经常失调。重要的是，这是一项关于METTL14在BlCa中功能的全面研究，除了评估其敲低对活力，细胞凋亡，迁移和入侵特性的表型影响外，还评估了其在120个人类患者样本和8个不同细胞系中的表达。METTL14-KD和随后的m6A下调降低了BlCa细胞的恶性表型，表明METTL14在BlCa中具有致癌作用。