走进单细胞10X genomics

了解什么是UMI，什么是barcode，再做分析之前，知道他们是在测序中引入，了解为什么引入即可。

看个简介的视频吧

从了解10X genomics开始
陈巍学基因：http://www.iqiyi.com/w_19rvim699t.html，内容大致如下：

10X 芯片测序

每一列孔对应一个样本
1：放样本序列
2：放预制微珠（gel beads）
3：放油的（油包裹）
最上面：是在做好乳浊液后，回收乳浊液的孔

它可以做两个事情：

• 第一件事情是可以做一群细胞当中，每个单细胞的RNA表达情况的定量分析
• 第二件事情是可以做染色体的单倍体长片段的组装

解决问题：搞清楚数量较大的一群细胞，比如说几千个细胞当中每个细胞的mRNA表达分别有什么特征以及这些细胞按mRNA的表达特征来分，大致可以分成哪几类。

微珠上引物的设计：

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每个凝胶微珠上，种上特定的DNA片段，分为几段DNA序列

• 第一段序列：16nt的barcode，一共有400百万种barcode，一个微珠对应于一种barcode。通过这400百万个barcode，可以吧凝胶为主给区分开。

• 第二段序列：UMI序列，“unique multiplex index”的简称，是一段随机序列，也就是说每一个DNA分子（后面会被oligodt pcr上于最后面），都有自己的UMI序列。10个碱基长的UMI，有100万种序列的变化（4的10次方=1048,,576）.作用：经过PCR，在深度测序得到的reads，可以看出哪些reads是来自于一个原始的cDNA分子的，这样就可以把起源于同一个cDNA分子的。因为PCR扩增会产生的多个reads，简并成一个原始的cDNA分子，也就是说可以排除各种cDNA，因为PCR扩增效率的不同而导致最后reads数量的偏差，也就是排除PCR bias。

可以这样理解：barcode是每个凝胶微珠的身份证号码；UMI是每个DNA标签分子的身份证号码

• UMI后面是ploy dt序列，作用：与mRNA的poly(A)尾巴结合，作为逆转录的引物，逆转录出cDNA来

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细胞混悬液（第一个十字的箭头进入的就是细胞液）在第一个十字交叉口，与凝胶微珠（原始的离心管的就是凝胶微珠）混合到一起，然后进入第二个十字交叉口，油相在这个十字交叉口加入进来，油把凝胶微珠和细胞混悬液包裹成一个又一个的油包水的小液滴。这样，小液滴里面是水相，外面是油相。

小微滴.png

白色圈圈就是细胞，其他颜色的就是微珠。有的小液滴包含细胞，有的包含两个细胞（最下面的绿色凝珠），大部分的细胞会被分配到一个小液滴当中。细胞混悬液中约65%的细胞，会被包到有微珠的小液滴当中

做测序文库

在得到乳浊液之后，接下来吧细胞膜破掉，让细胞当中的mRNA游离出来。

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也就是和逆转录酶、结合在凝胶微珠上的核酸引物、dNTP底物相接触，接着发送逆转录反应，mRNA与凝胶微珠上带标签的DNA分子相结合，逆转录酶作用下，逆转录出cDNA来。

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还会携带各自特定的UMI标签
有barcode和UMI序列：可以把这个cDNA分子就与其他的cDNA分子区分开。

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文库

测序

一次测序几百-几千个细胞（可能现在更多个），barcode种类400万种，所以大部分细胞，一个细胞对应一个barcode。通过barcode拆分数据，可以吧测序得到的reads归属到一个一个细胞。

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这种情况下，这几个细胞的reads就混合成了一个pool，为减少pool形成，在做细胞混悬液的时候，就要控制原始的细胞数，经验值是：一个样本的细胞混悬液中细胞数控制在1W以下为好。

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原始reads越多，则被测到的基因数也会越多。

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也就是被读到的基因数量的增加进入平台期。

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平均一个细胞的一个gene有10个左右的UMI，就可以对细胞进行分析，一个细胞一个基因表达量的多少，就是衡量这个细胞的一个维度，几千个被测到的基因的表达量，也就是形成几千个维度。

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以上是对10X genomics系统对单细胞 RNA表达量分子工作的一个简要介绍

其他资料：

10x Genomics平台介绍：http://www.berrygenomics.com/tech-services/10x-genomics-e5-b9-b3-e5-8f-b0-2/10x-genomics-e5-b9-b3-e5-8f-b0/

技术原理.png

应用.png

• 10x Genomics辅助基因组组装：http://www.berrygenomics.com/tech-services/10x-genomics-e5-b9-b3-e5-8f-b0-2/10x-genomics-e8-be-85-e5-8a-a9-e5-9f-ba-e5-9b-a0-e7-bb-84-e7-bb-84-e8-a3-85/
• 10x Genomics 单细胞转录组测序：http://www.berrygenomics.com/tech-services/10x-genomics-e5-b9-b3-e5-8f-b0-2/10x-genomics-e5-8d-95-e7-bb-86-e8-83-9e-e8-bd-ac-e5-bd-95-e7-bb-84-e6-b5-8b-e5-ba-8f/

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linux命令的复习视频：
linux视频：http://www.iqiyi.com/w_19rudlo7vt.html?pltfm=11&pos=title&flashvars=videoIsFromQidan%3Ditemviewclk_a#vfrm=5-6-0-1&vfrm=pcw_home&vfrmblk=A&vfrmrst=712211_history_button