《学习小组Day7笔记--旮旯里的山大王》

Day 7--测序知识学习笔记

学习内容:

  • 怎么区分一二三代测序
  • 二代测序大体流程
  • NGS组学都包括哪些分类(粗略)

1. 测序过程和原理

公司是怎样测序的,数据怎么来的?
现在的测序平台基本都是illumina公司出品的,所以先看一下他们的原理介绍视频,查一下专业术语。
原理介绍视频:https://share.weiyun.com/5qojuBY 密码: 密码:bxsry4
文章《测序的世界》:https://www.jianshu.com/p/101c14c3a1d2

  • 这一篇初学者暂时只看测序原理部分;
  • 若有疑问:搜狗微信—搜索“测序原理” 。
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1.1 第一代测序技术

来源:1、2、3、4代测序技术原理详解!
【陈巍学基因】视频25:第一代DNA测序

第一代测序技术-Sanger法测序,Sanger法是基于DNA合成反应的测序技术,又称为SBS法、末端终止法、双脱氧法测序。1975年由Sanger提出,并于1977发表第一个完整的生物体基因组序列。

核心原理:由于双脱氧核苷酸(ddNTP)的3’位置脱氧,其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键,因此可以用来中断DNA合成反应,在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP(分为:ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP),通过凝胶电泳和放射自显影,根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。

在每个反应体系中,ddNTP相对于dNTP是很少的,所以只有部分新链在不同的位置特异性终止,最终就会得到一系列长度不一的序列。

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图片来源:https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzU4NjU4ODQ2MQ==&mid=2247483720&idx=1&sn=c28fe56afdbe788a65f98d79eae89189&chksm=fdf8490aca8fc01c4b5d4b4347cc31d78626f7d9a57c4fce10d74c011a836e583a5045f4a1bf&scene=21#wechat_redirect

1.2 第二代测序原理

来源:1、2、3、4代测序技术原理详解!

以Illumina平台为代表的第二代测序技术实现了高通量测序,有了革命性进展,使得大规模并行测序成为现实,极大推动了生命科学领域基因组学的发展。Illumina循环SBS法(cycle SBS)即SBRT(Sequencing By Reversible Termination,可逆终止)的核心技术是DNA合成的可逆性末端循环,即3'-OH可逆性的修饰和去修饰。

基本原理:将dNTP的3'-OH以叠氮集团RTG(Reversible Terminating Group,可逆末端基团)进行修饰;将4种碱基分别与不同的荧光分子连接;DNA合成时,RTG能起到类似于ddNTP的作用终止反应;每次合成反应终止并读取信号之后,洗脱RTG和荧光分子,进行下一轮循环。

主要过程:
a, DNA待测文库构建
利用超声波把待测的DNA样本打断成小片段,并在这些小片段的两端添加上不同的接头,构建出单链DNA文库。这些文库中的DNA在通过flowcell(吸附流动DNA片段的槽道)时会随机附着在flowcell表面的channel上。每个Flowcell有8个channel,每个channel的表面都附有很多接头,这些接头能和建库过程中加在DNA片段两端的接头相互配对,并能支持DNA在其表面进行桥式PCR的扩增。

Illumina测序一般流程:

(1)文库制备,将DNA用酶切或超声波随机片段化成几百碱基或更短的小片段。通过填充和核酸外切酶把DNA片段补成平末端,紧接着磷酸化并增加一个dATP核苷酸黏性末端。然后将Illumina测序接头与片段连接。

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(2)簇的创建,将模板分子加入测序板 (flow cell) 用于产生克隆簇和测序循环。芯片有8个纵向泳道(lane)的硅基片。每个泳道内芯片表面有无数的被固定的单链接头。一个Flow cell可以测定多个样品,我们可以一段barcode来区分不同样品(通常barcode存在与adaptor与测序片段之间)。所以如果你的样品较少,公司不会给你单独上机测序,要等样品足够多,一次性上机。

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上述步骤得到的带接头的DNA 片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构,以供后续的预扩增使用。通过桥式PCR不断循环获得上百万条成簇分布的双链待测片段,该步骤将模板DNA扩增,具有一定扩增偏好性。

(3)测序,分三步:DNA聚合酶聚合带荧光且具有保护基团的NTP(可终止反应),荧光标记簇成像,保护基团被切除进行下一个循环。因为该测序方法先对插入片段的一端进行测序,其后对另一端进行测序,因此通常产出数据常为成对的reads.

(4)数据产出。

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1.3 第三代测序技术-单分子测序技术

未看

2. 从研究对象上给高通量测序分类

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3.测序发展史

测序发展史:150年的风雨历程

学习总结:感谢老师为期一周的学习指导,感觉路还很长,又一鼓作气报名了生信技能树的线上课程,希望能入门。
其实第七次课,我的生物学知识还需要补,本人是学中药的,但是现在大趋势,必须要继续学习啊!!!加油!!!
再次感谢花花老师和刘老师。

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