Nature | 细胞外流体粘度增强细胞迁移和癌症扩散
原创 huacishu 图灵基因 2022-11-16 10:11 发表于江苏
收录于合集#前沿分子生物学机制
撰文：huacishu
IF=69.504
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亮点：
1、作者证明，细胞外流体粘度的升高增加了二维表面和界面上各种细胞类型的运动性，并增加了三维肿瘤球体的细胞扩散；
2、作者指出肌动蛋白重塑/动力学、NHE1介导的肿胀和基于RHOA的收缩性的协同作用有助于在粘度升高时增强细胞运动性；
3、作者指出这项研究为控制癌细胞的转移潜力开辟了一条新的途径。
约翰霍普金斯大学Konstantinos Konstantopoulos教授课题组在国际知名期刊Nature在线发表题为“Extracellular fluid viscosity enhances cell migration and cancer dissemination”的论文。细胞对物理刺激做出反应，如硬度、流体剪切应力和液压。细胞外液体粘度是一个关键的物理线索，在生理和病理条件下（如癌症）会发生变化。然而，它对癌症生物学的影响以及细胞感知和响应粘度变化的机制尚不清楚。
本文作者证明，粘度的升高增加了二维表面和界面上各种细胞类型的运动性，并增加了三维肿瘤球体的细胞扩散。粘度升高引起的机械负荷增加诱导了肌动蛋白相关蛋白2/3（ARP2/3）复合物依赖的致密肌动蛋白网络，其通过肌动蛋白结合伴侣ezrin增强Na+/H+交换器1（NHE1）极化。NHE1促进细胞肿胀和膜张力增加，进而激活瞬时感受器电位离子通道蛋白V4（TRPV4）并介导钙输入，导致RHOA依赖性细胞收缩力增加。
肌动蛋白重塑/动力学、NHE1介导的肿胀和基于RHOA的收缩性的协同作用有助于在粘度升高时增强运动性。预先暴露于高粘度的乳腺癌细胞通过Hippo途径的转录控制获得TRPV4依赖性机械记忆。细胞外黏度是一种物理线索，可调节与癌症生物学病理生理相关的短期和长期细胞过程。
细胞迁移对于多种病理生理过程至关重要，如发育、组织稳态、免疫监测和癌症转移。尽管细胞-基质相互作用和周围流体产生的机械力已被证明可以调节细胞迁移行为，但生理相关的细胞外粘度对细胞功能的影响仍不清楚。
迄今为止，大多数体外细胞功能，包括运动性，都是在粘度接近水（0.7 厘泊（cP，一种粘度单位））时测定的。然而，间质液的粘度变化高达3.5cP，并且可以通过大分子（如粘蛋白）进一步增加，大分子不仅由各种组织中的上皮细胞分泌，而且由肿瘤细胞分泌。值得注意的是，全血的生理粘度在4至6cP之间变化，在病理异常时可能超过8cP。
先前的研究表明，超生理粘度(≥40cP）增加癌细胞和正常细胞在二维（2D）表面上的运动性。尽管如此，关键的基本问题仍然没有得到解答，包括细胞如何感知细胞外黏度升高；粘度升高是否改变细胞表型和细胞运动的潜在机制；细胞骨架如何与离子通道和转运蛋白协同作用以介导高粘度下的有效迁移；体外观察到的更快的运动是否转化为体内环境，如果是，细胞暴露于高粘度是否会影响癌症转移。
流体粘度增强细胞迁移
为了研究细胞外液粘度增加对体外细胞功能的影响，将65 kDa甲基纤维素加入细胞培养基中，在37℃下获得粘度为0.77cP（0%）至8cP（0.6%）的培养基 ，而不会明显改变介质的渗透压。
以MDA-MB-231乳腺癌细胞为模型，作者发现基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的限制通道随着细胞外粘度的增加而增加，在5–8cP处达到峰值（图1a）。使用不同的肿瘤细胞（来源于乳腺癌的MDA-MB-231-BrM2脑转移细胞（以下简称BrM2）、SUM159乳腺癌和人骨肉瘤（HOS））和非癌细胞（正常人成纤维细胞和人主动脉平滑肌细胞（hAOSMC）），也观察到粘度升高时的迁移速度加快（图1b）。
结果表明，粘度升高也增强了2D胶原蛋白I涂层基底上的随机细胞运动（图1c），并减少了2D伤口闭合所需的时间，而相对于基线粘度，细胞增殖没有改变。此外，粘度升高加速了MDA-MB-231细胞从三维（3D）乳腺癌球体中的分离（图1d，e），并减少了细胞进入限制通道的时间。总之，作者的数据将细胞外液粘度确定为在各种生理相关的2D和3D环境中调节运动的物理线索。
粘性力诱导肌动蛋白重塑
当肌动蛋白聚合被高剂量（2µM）的latrunculin a（LatA）消除时，乳腺癌细胞可以在0.77cP的限制通道中迁移。相比之下，与细胞的间充质迁移模式一致，LatA在8cP的限制下停止运动，表明粘度介导肌动蛋白的机械负荷及其随后的重组。
与0.77cP的细胞相比，在8cP的2D表面上的细胞显示出大的富含F-肌动蛋白的板状伪足（图1f）和明显更高的投影面积（图1g）。8cP细胞也显示出前缘板层生长更快（图1h）。使用肌动蛋白细胞骨架的随机光学重建显微镜（STORM）分析证实8cP的细胞在生长边缘内呈现出密集、高度分支的网络（图1i，j）。
尽管该模型预测了F-actin密度的总体增加（图1k），但更详细的评估显示，在施加较高的粘性力后，尖头端与带帽倒钩端相比出现了峰值。这一发现表明，随着新的肌动蛋白丝形成，其尖端连接到母丝上，分支肌动蛋白网络增加。
与ARP2/3在分支肌动蛋白成核中的既定作用一致，8cP的细胞在其前缘，特别是在突起丝的尖端，表现出更强烈的ARP3信号，而在2D表面和内部限制的细胞中，在基线粘度下检测到相对均匀的分布（图1l，m）。因此，使用靶向ARP3和/或ARPC4的短发夹RNA（shRNA）敲除ARP2/3或使用ARP2/3特异性抑制剂CK666抑制了粘度升高但不是基线粘度的限制性迁移（图1n）。
总之，结果证明ARP2/3介导的肌动蛋白分支作为对粘度增加的直接细胞反应发生。接下来研究了细胞感知和适应流体粘度升高的途径。
粘度诱导NHE1依赖性细胞肿胀
使用共聚焦成像证明，粘度升高（8cP）使MDA-MB-231细胞在非限制2D表面和内部限制通道上的体积增加了约40%（图2a）。鉴于NHE1在调节体积增加和限制迁移中的既定作用，作者研究了其极化模式、活性水平和在不同粘度下对运动的功能贡献。与先前的研究一致，NHE1在0.77cP时优先定位于受限细胞的前缘（图2b，c）。
有趣的是，监测的细胞前部的NHE1极化和NHE1活性，在8cP时显著增加（图2b–d）。NHE1耗竭消除了2D表面和限制中细胞的粘度诱导的体积增加（图2e）。模型预测表明，NHE1介导的离子通量的消除对8cP处迁移速度的抑制作用高于0.77cP时，使用shNHE1实验验证了这一点（图2f）。
NHE1、膜张力和TRPV4的相互作用
当细胞暴露于机械扰动时，细胞表面的力平衡表明细胞膜张力发生变化，这可能导致膜通道激活，从而使细胞能够感知外部线索并通过机械/渗透敏感离子通道（MOSIC）介导钙内流作出反应。与这一概念一致，暴露于高粘度（8cP）的细胞显示出膜张力（图2g，h）以及钙尖峰数量（图2i）的显著增加。与流体粘度对纤毛上皮细胞的影响一致，暴露于8cP的细胞显示出增加的全细胞TRPV4电流和钙振荡，shTRPV4或TRPV4抑制剂HC067047的处理消除了这些振荡。
根据粘度对受限细胞迁移的钙依赖性影响，TRPV4敲除足以消除粘度诱导的受限细胞运动性增强（图2k），从而说明TRPV4是由细胞外粘度升高激活的关键MOSIC。总之，粘度升高促进NHE1依赖性细胞肿胀，这导致膜张力增加，从而触发通过MOSIC TRPV4的钙内流。根据所提出的模型，NHE1抑制消除了粘度介导的膜张力增加（图2h）、全细胞TRPV4电流（图2l）和钙尖峰（图2i）。这些发现强调了TRPV4在调节钙通量中的关键作用，以响应NHE1介导的细胞体积和由粘度升高引起的膜张力增加。
接下来研究了肌动蛋白因粘度升高而产生的固有负荷适应是否与NHE1定位、NHE1依赖性细胞体积和膜张力增加以及TRPV4介导的钙信号传导有关。ARP2/3抑制阻断了粘度诱导的细胞体积、膜张力和钙活性的增加（图2h，n）。随后重点研究了ezrin，一种将NHE1锚定在细胞膜上的肌动蛋白结合蛋白。用ezrin和NHE1共同染色的受限细胞的免疫荧光分析显示，在所有粘度下都存在显著的共定位（图2o）。有趣的是，相对于基线粘度的升高导致NHE1和ezrin在细胞前缘的极化更高（图2o，p）。
总之，粘度升高会施加机械负荷，这会在细胞前缘触发更密集的肌动蛋白网络的形成，在该网络处，ezrin富集促进NHE1极化和NHE1依赖性细胞肿胀。这导致膜张力增加，进而激活TRPV4并调节钙内流。
TRPV4增强细胞收缩力
鉴于TRPV4与RHOA–ROCK–肌球蛋白II途径的调节相关，研究了RHOA活性的空间定位及其在高粘度下细胞运动的潜在作用。与0.77cP相比，胶原蛋白I覆盖的2D表面上的细胞在8cP下表现出更高的RHOA活性（图3a，b）。粘度诱导的RHOA增加由TRPV4调节，因为TRPV4耗竭将RHOA活性降低到基线水平（图3c）。数据表明，敲低编码TRPV4上游激活剂的NHE1或通过BAPTA进行的钙螯合消除了8cP时RHOA活性的增加，进一步证实了这一点。
值得注意的是，8cP的细胞主要表现出突出的形态，主要在其前缘表现出升高的RHOA活性。使用RHOA活性的报告物验证了这些发现，该报告物包含融合到GTP–RHOA结合苯胺同源结构域（GFP–AHD）的GFP（图3d–f）。与8cP时细胞前部的NHE1富集一致（图2b，c），用EIPA21（图3e）抑制NHE1或GSK2193874（图3f）抑制NHE1的下游效应物TRPV4将8cP处活性RHOA的空间定位恢复为0.77cP处的空间定位。
RHOA–ROCK轴激活基于肌球蛋白II的收缩力，产生高的区域细胞内压力，使细胞能够在8cP的迁移过程中克服升高的阻力。肌球蛋白IIA（MIIA）–GFP的活细胞成像（图3g）和肌球蛋白轻链2（pMLC）磷酸化（Ser19）的免疫染色表明，在8cP迁移的受限细胞的前缘，肌球蛋白II活性升高。MIIA（而非MIIB）将8cP的运动性降低至基础水平（图3h），从而将MIIA确定为8cP肌动球蛋白收缩力的主要效应器。
总之，作者证明，细胞外黏度升高导致细胞前缘的机械负荷，从而诱导固有肌动蛋白重塑，促进NHE1通过其结合伴侣ezrin募集到细胞膜。细胞前部的NHE1富集通过水摄取增加细胞体积，这导致膜张力增加，进而触发TRPV4的激活以介导钙进入并上调下游RHOA介导的收缩性（图3i）。
TRPV4和Hippo介导的粘性记忆
到目前为止，所有体外试验都是使用在基线粘度（0.77cP）下培养的细胞进行的，并经受粘度升高，这足以赋予细胞增强的迁移倾向。有趣的是，预处理8cP粘度6天，并且在8cP下甚至在0.77cP下迁移，也表现出增强的迁移潜力（图4a，b），这被TRPV4耗竭所消除（图4c）。同样，细胞在2cP下预处理6 天再将培养基粘度切换回0.77cP后，保持了同样快的运动性。这些数据共同表明，细胞可以感知并保持对其在转移级联中任何点所暴露的细胞外粘度的记忆。
为了确定粘度诱导的更快细胞迁移的体内相关性，将MDA-MB-231乳腺癌细胞在8cP（预处理）或0.77cP（未处理）下培养6 天，并注射到斑马鱼胚胎。使用共聚焦显微镜追踪狭窄节段间血管（ISV）中的细胞运动（图4d，e）。与体外研究结果一致，相对于原始细胞，预处理的细胞以显著更高的速度移动（图4f），并在鱼胚胎的ISV内持续存在。
粘性记忆促进癌症传播
MDA-MB-231细胞，在3cP（预处理）或0.77cP（初始）下培养6 天，以基线粘度重新悬浮并注射到鸡绒毛尿囊膜（CAM）血管系统中。与原始细胞相比，预处理细胞在体内表现出更高的外渗潜力。类似地，在尾静脉注射后48小时，小鼠肺部预处理（8cP）肿瘤细胞数量明显高于未处理（0.77cP）的肿瘤细胞数量（图4g，h）。48小时检测到的单细胞集落最终导致3周后肺部形成更多转移灶（图4g，i，j）。
这些观察表明，相对于原始细胞，预处理的细胞更容易渗入肺部，导致接种后3周小鼠的转移负担更大。与TRPV4在体外增强预处理细胞迁移倾向方面的关键作用一致，TRPV4耗竭消除了预处理细胞相对于未处理细胞在48小时和3周时间点在体内的增强潜力（图4k，l）。qPCR证实了预处理细胞在体内形成转移的能力增强（图4m，n）。
结论
作者说明了细胞外液粘度是一种物理线索，有助于体外更快的运动和细胞从3D肿瘤球体中分离，以及动物模型中的外渗和癌症扩散。考虑到体内与生理相关的流体粘度高于水的粘度，以及细胞可以发展粘度记忆的事实，这项研究为控制癌细胞的转移潜力开辟了一条新的途径。
教授介绍
Konstantinos Konstantopoulos教授以其在工程、生物学和医学与癌症转移应用的交叉研究而闻名。他是化学和生物分子工程教授。Konstantopoulos的小组致力于阐明血管和组织微环境如何在转移过程中调节癌细胞从原发肿瘤向全身器官的扩散。他的工作的最终目标是开发新的诊断和预后工具，以预测癌症进展的可能过程和患者结局，并设计治疗策略，以使用定向多学科方法对抗癌症转移。迄今为止，他开创了对肿瘤细胞优先表达的新型粘附分子的鉴定和生物物理表征，这些分子有助于肿瘤细胞在体内的转移扩散。这些基础科学发现揭示了肿瘤细胞在转移过程中所利用的未知机制，并开辟了对抗这种致命疾病的新途径。
参考文献
Bera K, Kiepas A, Godet I, et al. Extracellular fluid viscosity enhances cell migration and cancer dissemination. Nature. 2022;10.1038/s41586-022-05394-6. doi:10.1038/s41586-022-05394-6