【转录组】文库数据标准化方法RPKM FPKM TPM CPM RPM（理论篇）

文库标准化的目的

RNA-seq每个基因的长度和深度均不相同，所以需要对基因的长度和测序深度进行Normalize

输入

一个Read Count的数据矩阵（行为基因，列为样本）。

第一种 RPKM (适合于单端测序）

这个就很简单粗暴地将基因的reads数 除以 测序reads数（去除测序深度效应）和基因长度（去除基因长度效应）

• RPKM是Reads Per Kilobase per Million mapped reads的缩写

计算公式：

RPKM = total exon reads / (mapped reads(Millions) * exon length(KB))                            

total exon reads：某个样本mapping到特定基因的外显子上的所有的reads；

mapped reads (Millions) :某个样本的所有reads总和；

exon length(KB)：某个基因的长度（外显子的长度的总和，以KB为单位）

第二种 FPKM （适合于双端测序）

FPKM（Fragments PerKilobase Million）: Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments

FPKM和RPKM的计算方法基本一致，只不过把reads换成了Fragments。

• 单端测序：FPKM等同于RPKM
• 双端测序：
  • 如果一对paired-read都比对上了，这一对paired-read称之为一个fragment
  • 如果只有一个比对上了，就将这个比对上的read称为一个fragment。
  • 一对paired-read会当成两个read分别计算

计算公式

FPKM = total exon Fragments / (mapped reads(Millions) * exon length(KB))

第三种 TPM

TPM（Transcripts PerKilobase Million）：Transcripts Per Kilobase of exon model per Million mapped reads

计算公式

TPMi=(Ni/Li)*1000000/sum(Ni/Li+……..+ Nm/Lm)

• Ni：mapping到基因i上的read数；
• Li：基因i的外显子长度的总和

一个样本中某基因的TPM值的计算方法：先对每个基因的read数用基因的长度进行校正，之后再用校正后的这个基因read数(Ni/Li)与校正后的这个样本的所有read数（sum(Ni/Li+……..+ Nm/Lm)）求商

在计算TPM是先对基因长度进行标准化，之后再对列进行标准化。

这样使得最终的TPM矩阵的每列总和都相同（等于1000000），也就是说每个样本中的TPM的总和都是一样的。理论上，这使得我们更容易比较不同样本中所占同一基因的read数的比例。

学术界已经不再推荐RPKM、FPKM, 比较基因的表达丰度，例如哪个基因在哪个组织里高表达，用TPM做均一化处理；

第四种 CPM

Counts per million

计算公式：

CPM= A/mapped reads*1000000 

• A为比对到某基因的reads数（read count）
• mapped reads为比对到所有 gene 的总reads 数。

用途：在某些情况下，只想了解每个基因被覆盖到的相对reads数，而不希望对其做长度校正，就会使用这个指标。

CPM只对read count相对总reads数做了数量的均一化。当如果想进行表达量的基因间比较，则不得不考虑基因长度的不同。如果进一步做长度的均一化，就用RPKM。

第五种 RPM

与CPM相似

计算公式

RPM = Total exon reads/ Mapped reads(Millions)

学习自

• RPKM, FPKM, TPM有什么区别？
• [转录组] Read count，CPM和RPKM的区别是什么？
• RPM(CPM)/RPKM/FPKM/TPM
• FPKM、TPM数据标准化
• RNA_Seq分析中的标准化（reads_count,FPKM, RPKM, TPM)