还在苦恼自己文章为什么过不了审？你稳转株挑单克隆了吗！

稳转细胞株是指在某一细胞株中过表达或抑制某一特定基因的细胞系。通过将特定基因的DNA或shRNA构建到重组载体上，借助慢病毒系统或转座子系统将目的基因的表达框导入宿主细胞并整合到染色体上，以实现目的基因长时间的稳定表达。对比瞬时转染法，慢病毒稳转法和转座子稳转法能有效提高转染效率，进一步提高目的基因的表达效率。

什么时候需要使用到稳转细胞株呢？

1.当需要在目的细胞中长时间研究某一基因功能时，构建稳转细胞株可持续有效保证基因的表达水平，减少反复转染，避免成本和人力浪费；

2.通过诱导表达系统操控基因表达，可以让目的基因在特定时空表达，例如：研究管家基因或者致死基因功能时，诱导表达系统是极佳的选择；

3.当目的细胞中蛋白功能持续时间较长时，瞬时抑制无法有效去除已经表达的蛋白功能，构建稳转的敲降细胞株，可以稳定维持基因低水平表达或不表达，增加实验数据的稳定性和真实性；

4.当需要进行药物筛选、构建重组蛋白、生产制备抗体等都需要可以选择稳转细胞株。

稳转细胞株pool和单克隆如何选择？

目前对于稳转细胞株的运用，国内主要仍集中在混合细胞阶段，利用病毒感染细胞、药物筛选后，可初步用于实验分析，其优点是能快速获得实验结果，分析实验数据趋势。若实验持续时间较长，需要不间断地添加药物筛选，以维持混合细胞池中，高表达稳转细胞株的比例，实验结果会随着稳转株细胞量占比的变化而有所波动，数据稳定性与有效性难以保证，不仅难发高分文章，可能最后你的实验结论还会来个“两极反转”。

如果将混合细胞池进行单克隆分选，可得到不同过表达量的细胞系，后续实验研究将拥有不同表达水平单克隆细胞株的选择。由单一细胞形成的细胞团，基因表达量相对均匀，利于维持稳转细胞系的稳定性和均一性，减少重复实验的波动性。这些单克隆细胞株是研究基因调控关系、蛋白质功能和研究生物试剂特异性的重要工具。因此源井生物为了保证交付能挑单克隆的稳转株，一直秉承着“单克隆级别”稳转株的服务准则：细胞来源权威，精研最优转染培养体系与最佳MOI值，独家生长体系显著提高单克隆生长速度与形成率，轻松挑取单克隆！

案例1：过表达单克隆筛选在耐药细胞株中的应用研究

化学药物治疗癌症时，最常见的难题是产生耐药性。p -糖蛋白(P-gp)是由MDR1基因编码的ATP结合盒(ABC)转运蛋白。过表达P-gp会导致活性药物向外转运增加，降低其在细胞质中的有效浓度和细胞毒性效果，从而引发多药耐药性（MDR）。Caveolin-1是一种小泡外膜蛋白，能与H-ras、蛋白激酶Cα、G蛋白、eNOS、src家族酪氨酸激酶和EGFR等多种蛋白相互作用，参与调控信号转导。癌症、糖尿病、阿尔茨海默病、心血管疾病和肌肉萎缩症等多种病症中可见Caveolin-1蛋白的异常的表达。为了探究caveolin-1与P-gp相关的分子机制，在多药耐药株Hs578T/Dox乳腺腺癌细胞中过表达caveolin-1，并通过单克隆筛选，获得持续高表达caveolin-1的单克隆细胞株。挑选caveolin-1表达量最高的单克隆细胞株进行后续研究，通过检测单克隆细胞中P-gp和MDR1基因的变化，比较细胞的耐药和P-gp转运活性发现，过表达caveolin-1的单克隆通过抑制MDR1基因的表达来降低耐药。

案例2：单克隆稳转株在疫苗研发中的应用

中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)是从一名来自沙特阿拉伯急性肺炎伴肾功能衰竭的患者体内分离得到，是继SARS-CoV之后出现的一类高致病性冠状病毒。MERS-CoV以CD26作为受体感染宿主，能引起人体多种器官感染。MERS-CoV刺突蛋白存在受体结合结构域（RBD），MERS-CoV RBD在宿主受体结合、膜融合和细胞进入等方面发挥着重要作用，因此该结构域也是疫苗研发的重要关注点。在小鼠和兔子模型中，重组人源的Fc片段和MERS-CoV RBD残基可提高MERS-CoV抗体的表达量，并对近20株人类和骆驼的中东呼吸综合征冠状病毒株表现出强有力的活性。该类抗体主要是通过阻断中东呼吸综合征冠状病毒株RBD与细胞表面受体DPP4的结合从而阻止侵入细胞。疫苗初期的研究和制备，可通过HEK293细胞系表达和纯化得到。大量制备疫苗时则需要一株能稳定大量表达MERS-CoV蛋白疫苗抗原的细胞株。将过表达MERS-CoV蛋白的susCHO进行单克隆培养，通过ELISA筛选鉴定到一株MERS-CoV蛋白表达量最高的单克隆细胞。通过比较单克隆susCHO细胞与pool-susCHO细胞的生长曲线发现，两株细胞在培养的第7天时间达到最大的细胞量，细胞密度分别是 8×106cells/mL和 7×106cells/mL(图A)。将培养7天的培养基上清进行SDS-PAGE检测发现，每1L的培养基上清中，单克隆susCHO细胞比pool-susCHO的上清中的浓度多表达32mg MERS-CoV蛋白。由此可见，通过单克隆分选可挑选细胞状态最佳，蛋白表达量最合适的克隆，通过单克隆化的克隆能显著提高抗体的产量，提高经济效益。