2022-04-23

Nature| 实体瘤中CART细胞杀伤的特有机制

原创 骄阳似我 图灵基因 2022-04-23 07:03

收录于合集#前沿分子生物学机制

撰文：骄阳似我

IF：49.962

推荐度：⭐⭐⭐⭐⭐

亮点：

嵌合抗原受体（CAR）疗法对血液系统恶性肿瘤的治疗具有转化作用，但对实体瘤的疗效有限。实体瘤可能具有对CAR T细胞毒性的细胞固有抵抗机制。本文在胶质母细胞瘤中进行了全基因组CRISPR敲除筛查，发现干扰素-γ受体（IFN-γR）信号通路（IFNGR1、JAK1或JAK2）中的基因缺失使得胶质母细胞瘤和其他实体瘤在体外和体内对CAR T细胞的杀伤更具抵抗力。然而，这种途径的缺失并没有使白血病或淋巴瘤细胞系对CAR T细胞不敏感。

CAR T细胞疗法已经彻底改变了白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤的治疗，但迄今为止在胶质母细胞瘤和更广泛的实体瘤方面的成功有限。我们猜测除了实体瘤的抑制性肿瘤微环境外，还可能存在使实体瘤细胞对CAR T细胞杀伤更具抵抗力的细胞内在机制。

2022年4月13日，有科学家在Nature杂志上发表了一篇名为“CAR T cell killing requires the IFNγR pathway in solid but not liquid tumours”的文章，研究表明，液体和固体肿瘤与CAR T细胞的相互作用不同，并表明增强T细胞和肿瘤细胞之间的结合相互作用可能会改善实体肿瘤的反应。

本文在一个人类胶质母细胞瘤细胞系中进行了全基因组CRISPR筛查，以确定其缺失导致抗CAR T细胞杀伤的基因。使用一个包含76000多个指南的文库，针对约19000个基因，在人类U87胶质母细胞瘤细胞中诱导插入-缺失突变（INDEL），并评估对CAR T细胞毒性的突变抗性。两天的恢复期后，对存活下来的U87细胞进行CAR T细胞毒性分析，以确定产生耐药性的基因敲除。首先使用MAGeCK对基因进行全基因组测试，EGFR的基因敲除提供了最显著的生存优势。接下来的基因主要与干扰素-γ（IFN-γ）信号有关，JAK2、IFNGR1和IFNGR2排在前五位。GO分析以聚集基因间的信号，并验证该通路的整体重要性，发现IFNγ信号在CAR T细胞杀伤中的作用出乎意料。接下来制作了IFNGR1、JAK1和JAK2单基因敲除的U87细胞以验证该通路。三个敲除系在短期和长期对CAR T细胞杀伤具有相对抗性。图1：胶质母细胞瘤全基因组CRISPR筛查表明，IFNγR信号的丢失是抵抗CAR-Tcell细胞毒性的一种机制。

为了确定IFNγR通路作为胶质母细胞瘤的耐药机制的在其他肿瘤中的普遍性，测试了其他实体瘤类型。观察到IFNγR1-KO AsPC-1胰腺肿瘤细胞对靶向间皮素（一种内源性表达的表面抗原）的CAR T细胞毒性反应较弱，与野生型肿瘤相比，用间皮素导向的CAR（间皮CAR）治疗的IFNγR1-KO AsPC-1肿瘤显示肿瘤生长增加，生存效益降低。IFNγR1-KO胶质母细胞瘤U87细胞靶向IL13Rα2-CAR T细胞，卵巢癌细胞系SKOV3和肺癌细胞系A549靶向EGFR-CAR T细胞，与相应的野生型亲代肿瘤细胞系相比，靶向EGFR-CAR或Meso-CAR T细胞的胰腺细胞系BxPC-3和AsPC-1表现出更强的抗细胞毒性。为了确定IFNγR信号通路的缺失是否也在血液系统恶性肿瘤中起作用，生成了IFNγR1-KO Nalm6白血病细胞，并通过CD19-CAR T细胞测试了它们对细胞毒性的敏感性。CD19-CAR T细胞在体内抗IFNγR1-KO Nalm6肿瘤的肿瘤负荷和存活率方面与抗野生型Nalm6肿瘤的效果相同，并且对缺乏靶抗原的CD19-KO Nalm6细胞仍然没有显示出细胞毒性。因此，无论是通过遗传学还是药理学手段，IFNγR途径的丧失或抑制，都不会导致白血病患者对CAR T细胞介导的细胞毒性产生耐药性。之后评估了IFNγR信号在其他血液系统恶性肿瘤中的作用，CAR T细胞在临床上对这些恶性肿瘤产生了显著的反应，即淋巴瘤和多发性骨髓瘤。同样，与实体瘤相比，CD19-CAR靶向的淋巴瘤细胞系JeKo-1或BCMA-CAR靶向的多发性骨髓瘤细胞系RPMI-8226的IFNγR1基因敲除与各自的野生型对照相比，对细胞毒性的敏感性没有差异。图2：固体和液体肿瘤对IFNγR1基因敲除CAR T细胞毒性的敏感性差异。

假设实体瘤中观察到的IFNγR通路敲除的耐药性可能通过两种机制之一发生：（1）由于肿瘤反馈信号的丢失而导致CAR T细胞功能降低，和/或（2）肿瘤细胞对CAR T细胞介导的细胞毒性的固有抗性。为了测试是哪一种机制引起的，分析了EGFR-CAR T细胞与U87 IFNγR通路敲除物共培养的情况，观察到T细胞的增殖、活化、LFA-1表达和脱颗粒是可比的，表明肿瘤细胞本质上对CAR T细胞介导的细胞毒性有抵抗力。为了确定胶质母细胞瘤（而非白血病）中驱动IFNγR1介导耐药性的潜在机制，在与CAR T细胞共培养后对U87和Nalm6肿瘤细胞进行了表达谱分析。U87 IFNγR1-KO细胞显示出与EGFR-KO细胞相似的信号通路表达，而Nalm6 IFNγR1-KO细胞具有与Nalm6细胞相似的表达谱。这些模式表明，与液体肿瘤相比，实体肿瘤中的细胞对T细胞介导的细胞毒性具有不同的内在抗性机制。先前的研究表明，IFNγR信号传导导致PD-L1的上调，从而导致T细胞介导的应答产生耐药性。与野生型细胞相比，U87和Nalm6抗原阴性对照组的凋亡途径基因表达模式不同。证实了凋亡信号的丢失使白血病细胞对CAR T细胞产生耐药性，表明该途径在实体瘤对T细胞易感性中的作用较小。图3：CAR T细胞和携带IFNγR1基因敲除的肿瘤细胞的共培养在肿瘤中诱导不同的转录反应，而不是CAR T细胞。

竞争生存试验中，在CAR T细胞的选择性压力下，IFNγR1-KO胶质母细胞瘤细胞的数量增加了一倍，而白血病IFNγR1-KO与野生型细胞相比没有竞争优势。在暴露于CAR T细胞后，观察到胶质母细胞瘤中细胞粘附途径的差异富集，而非白血病细胞。为了进一步研究细胞粘附在CAR-T-实体瘤相互作用中的作用，使用动态声力测量来测量结合亲和力，发现与野生型细胞相比，CAR T细胞对IFNγR1-KO U87细胞的结合亲和力较低。在暴露于CAR T细胞后，检测了IFNγR1-KO和野生型U87细胞之间的顶部差异表达基因，并观察到ICAM1在野生型中高表达，但在IFNγR1-KO U87细胞中不高表达。IFNγR1-KO和野生型Nalm6细胞并非如此。尽管IFNγR1-KO和EGFR-KO U87细胞上的ICAM-1静息水平与野生型细胞上的ICAM-1非常相似，但野生型肿瘤细胞在暴露于EGFR-CAR T细胞后，在细胞表面和上清液中的RNA和蛋白质水平强烈上调ICAM-1。值得注意的是，IFNγR1-KO和EGFR-KO细胞没有显示ICAM-1的显著上调，Nalm6细胞也没有。暴露于CAR T细胞后，Nalm6细胞在其细胞表面和上清液中的ICAM-1表达仅略有增加，与IFNγR1表达无关。抗体介导的ICAM-1阻断减轻了EGFR-CAR T细胞对U87细胞的细胞毒性，但不降低CD19-CAR T细胞杀伤Nalm6细胞的能力。在传统的T细胞生物学中，T细胞上ICAM-1的配体LFA-1在免疫突触的形成中起主要作用，抑制该分子可以防止T细胞的细胞毒性。在U87细胞中敲除ICAM-1，并观察到与野生型细胞相比，CAR T细胞对这些细胞的细胞毒性显著降低。然后，将U87 IFNγR1-KO细胞转化为组成性表达ICAM-1，其水平与暴露于CAR T细胞后在野生型细胞上观察到的水平相似，并发现CAR T细胞与这些ICAM-1++细胞的结合亲和力增加。值得注意的是，所有T细胞，而不仅仅是CAR T细胞，对ICAM-1过度表达细胞系的细胞结合亲和力增强。然而，CAR T细胞对野生型U87细胞的结合亲和力仍显著高于EGFR-KO-ICAM-1转导的U87细胞。此外，当ICAM-1在IFNγR1-KO细胞系上过度表达时，EGFR-CAR T细胞的细胞毒性更强，但不会使CAR T细胞的细胞毒性独立于抗原，因为EGFR-KO细胞上的ICAM-1过度表达不会增加细胞溶解。图4：IFNγR1信号上调ICAM-1并使CAR T细胞毒性增强。

本文的数据强调了IFNγR信号在不同肿瘤类型中的重要差异作用，这对可能优化T细胞-肿瘤细胞粘附的潜在CAR T细胞设计或药物组合具有影响，尤其是在由于IFNγ传感缺陷而产生耐药性的情况下。

教授介绍：

Marcela V. Maus

Marcela V. Maus博士是过继细胞治疗领域的先驱。她是马萨诸塞州总医院 (MGH) 细胞免疫治疗主任和哈佛医学院助理教授。她在基因和细胞疗法方面拥有丰富的经验，特别是在 T 细胞活化生物学和过继免疫疗法的临床转化方面，包括基因修饰 T 细胞的监管和临床专业知识。她拥有超过 15 年的基础实验室研究经验，并获得了内科、内科肿瘤学和血液学的委员会认证，尤其是在黑色素瘤、骨髓瘤和骨髓移植方面的临床培训。她在将新型细胞和基因疗法从实验室带到临床方面拥有独特的专业知识，包括针对临床转化医学的地方和联邦监管程序。她领导着由科学家和临床医生组成的多学科团队，成功地在多发性骨髓瘤、白血病、间皮瘤、胰腺癌和卵巢癌以及多形性胶质母细胞瘤中开展了转基因 T 细胞试验。Maus 博士实验室继续专注于优化 T 细胞工程以用作过继免疫疗法。Maus 博士负责 MGH 的细胞免疫治疗项目，其中包括一个细胞治疗临床单位。在这个职位上，Maus 博士负责监督 MGH 免疫效应细胞疗法的临床和转化研究组合。她已成功开展转基因 T 细胞在多发性骨髓瘤、白血病、间皮瘤、胰腺癌和卵巢癌以及多形性胶质母细胞瘤中的试验。

参考文献：

Larson, R.C., et al., CAR T cell killing requires the IFNγR pathway insolid but not liquid tumours. Nature, 2022.