今天跟大家分享的是发表在Frontiers in Oncology（IF: 4.8483）上的一篇文章，主要是基于TCGA和CGGA中胶质瘤数据集，利用单样本基因集合富集分析(ssGSEA)算法根据胶质瘤基质细胞（GASC）含量对患者进行分型。基于xCELL和CIBERSORT算法分析基质细胞和免疫细胞的组成并建立神经胶质瘤的风险评分和nomogram预后预测模型。本文分析流程如图1所示。
Glioma-Associated Stromal Cells Stimulate Glioma Malignancy by Regulating the Tumor Immune Microenvironment
胶质瘤相关基质细胞通过调节肿瘤免疫微环境刺激胶质瘤恶化
图1.工作流程
1.数据
TCGA和CGGA中基因表达数据和预后数据。
2.高/低GASC亚型的识别
为分析GASC在胶质瘤微环境中的潜在机制，研究者基于TCGA和CGGA中的mRNA测序数据，通过 ssGSEA算法计算每个样本的GASC水平得分(图1)。根据GASC评分中值分别将TCGA和CGGA中样本分为高GASC组和低GASC组。TCGA和CGGA中高、低GASC组的临床相关信息以及GASC中marker基因表达如图2A-B所示。在TCGA和CGGA数据中，不管是在所有胶质瘤患者还是高级别胶质瘤患者中，高、低GASC分型患者之间的预后均存在显著差别（图2C-F）。主成分分析（PCA）表明高GASC和低GASC组之间GASC标志物的表达存在显著差异（图2G-J）。
图2. 高/低GASC亚型的识别
3. 高/低GASC亚型中差异基因的富集分析
分别对TCGA和CGGA中所有胶质瘤和高级别胶质瘤，在高/低GASC亚型之间发生差异表达的基因进行GO，KEGG和GSEA富集分析（图3，图4），富集分析结果表明免疫相关过程在高/低GASC两组患者中存在显著差异。
图3.所有胶质瘤中高/低GASC亚型之间差异表达基因的富集分析
图4.高级别胶质瘤中高/低GASC亚型之间差异表达基因的富集分析
4.干细胞打分、间质上皮细胞转化、肿瘤相关细胞因子和血管生成活性评分与GASCs分型的相关性
为进一步探索GASC在胶质瘤中的潜在机制，研究者还基于ssGSEA算法计算每个胶质瘤样本的干性、间质上皮细胞转化、肿瘤相关细胞因子和血管生成活性打分。结果显示，高GASC组中间质上皮细胞转化、血管生成活性评分等显著高于低GASC组(图5A)，并与所有胶质瘤群体(图5B-C)和高级别胶质瘤群体中(图5D-E)的GASC评分呈正相关。
图5.GASCs与干细胞打分、间质上皮细胞转化、肿瘤相关细胞因子和血管生成活性评分的相关性
5.GASCs和基质细胞打分的相关性
为探究GASCs和基质细胞之间相关性，研究者基于xCELL算法计算14个基质细胞的水平，分别计算高，低GASC组中14种基质细胞是否存在差异，基于单因素cox分析识别与预后相关的基质细胞，并基于皮尔斯相关分析计算GASCs打分和基质细胞打分之间相关性。分析结果表明，在所有胶质瘤人群中，高GASC组的内皮细胞、淋巴内皮细胞和微血管内皮细胞打分更高；间充质干细胞水平是胶质瘤的保护因素；GASC评分与内皮细胞、淋巴内皮细胞和微血管内皮细胞水平呈正相关(图6)。
图6.GASC打分和基质细胞打分的关联
6. GASCs和免疫之间的关联
研究者基于CIBERSORT算法计算22种免疫细胞的相对丰度（图7）。
图7.CGGA和TCGA种22种免疫细胞的相对丰度
总体而言，高GASC组的适应性免疫水平明显低于低GASC组。M2巨噬细胞水平在高GASC组中显著升高(图8A, C)，并与所有胶质瘤群体的GASC评分呈正相关(图9A)。单因素Cox回归也显示M2巨噬细胞水平是胶质瘤的危险因素(图8B, D)。在高级别胶质瘤人群中也可以观察到类似的结果(图8E- H, 9B)。
图8.GASCs和免疫细胞之间的关联
图9.GASC打分，免疫细胞丰度和免疫检查点基因表达之间的相关性
研究者进一步对GASC打分与14个重要免疫检查点基因的表达水平之间的相关性进行分析。如图10所示，在高GASC组中大多数免疫检查点基因的表达均存在不同水平的升高。单因素Cox回归分析显示PD-L2、TIM3等表达水平在所有胶质瘤人群和高级别胶质瘤人群中是危险因素。相关分析表明，免疫检查点基因的表达之间存在较强的正相关关系。在所有胶质瘤群体和高级别胶质瘤群体中，GASC评分与PD-1等基因表达之间呈正相关(图9)。以上结果进一步表明GASC评分与免疫调节过程存在内在关联。
图10.GASC打分与免疫检查点基因表达之间的相关性
除表达水平外，高GASC得分，低GASC得分和正常患者在THY1等免疫相关基因的甲基化水平上同样存在差异（图11A，C）。另外，这些基因的甲基化水平与胶质瘤患者预后相关（图11B，D）。以上结果首次表明，THY1甲基化可能是胶质瘤的潜在预后指标和治疗靶点。
图11.GASC打分与免疫检查点基因甲基化之间的相关性
7.预后打分模型的构建
研究者在进一步的筛选过程中基于GASC打分、干性打分、间质上皮细胞转化打分、肿瘤细胞因子打分、血管生成活性打分、基质细胞打分和免疫细胞打分等特征，通过lasso cox回归模型创建一个全面的风险打分。预后分析结果显示，不管是在训练数据还是在验证数据中，高低风险组的患者之间均存在显著预后差异（图12A-D），并且该风险打分是独立的胶质瘤预后指标（图12E）。研究者最终将4个特征(年龄、WHO分级、IDH突变状态和风险打分)纳入列线图模型(图12F)。ROC曲线下面积表明不管是在训练数据还是验证数据中，该模型的预测性能都显著优于IDH突变状态这一传统胶质瘤预后指标（图12G-J）。
图12.风险打分模型的构建与验证
今天的内容就是这些，是不是思路超级简单清晰呢？最后让我们再来对这篇文章进行一下总结吧，首先基于GASC打分将患者进行分型，进而对两类患者在免疫检查点基因表达，肿瘤细胞免疫浸润水平，生存时间等方面的特征进行比较和分析，探寻两类患者机制水平上存在的差异。最后基于GASC打分等构建新的打分模型，并与其他模型进行比较。
流程虽然简单清晰，但在自己分析时也不可以完全照搬哦，要有自己的“灵魂”和思想。“灵魂”和思想来自于精心研读的每一篇文章，来自于头脑风暴的每一次争吵，更来自于夜半时分的每一份思考。生信分析很简单，也很复杂，把简单的分析变复杂，把复杂的思路变简单，也许我们就成功了一半。