用于肺癌检查点免疫治疗反应预测的新型微生物组生物标志物（IF7+）

Local tumor microbial signatures and response to checkpoint blockade in non-small cell lung cancer

非小细胞肺癌的局部肿瘤微生物特征和对检查点阻断的反应

发表期刊：Oncoimmunology

发表日期：2021 Dec 10

DOI:  10.1080/2162402X.2021.198840

期刊相关信息

一、背景

        免疫检查点抑制剂 （ICI） 治疗，无论是单独使用还是与经典化疗药物联合使用，都是晚期非小细胞肺癌 （NSCLC） 的主要治疗方法，在没有靶向分子驱动改变的情况下，ICI是强大的治疗药物，利用免疫系统的天然特异性和适应性来重振抗癌免疫力，解决肿瘤异质性和癌症相关的免疫抑制。

        在整个肿瘤实体中，预测ICI反应的生物标志物包括目标抗原表达（如PD-1/PD-L1）、肿瘤突变负担（TMB）、DNA错配修复缺陷/微卫星不稳定性和基线时肿瘤T细胞浸润。然而，ICI反应性也依赖于宿主微生物组的组成和功能质量。微生物在胃肠道（GI）中特别丰富，而且该区间的某些物种（主要是细菌共生体）已被证明通过各种免疫学和代谢机制与ICI疗效相关。

二、材料与方法

1.数据来源

支气管镜（n = 35）和手术（n =3）活检来自38名接受ICI治疗的晚期NSCLC患者；宏观上无肿瘤的健康邻近肺组织来自接受治愈性手术治疗的NSCLC患者，用于对照（n = 10）

2.实验流程

  16S rRNA基因扩增子测序：使用Illumina MiSeq技术对支气管镜（n = 35）和外科（n = 3）NSCLC活体组织以及健康肺部对照组织（n = 10）进行16S rRNA测序

数据分析和统计：使用香农多样性指数（SDI）以及观察到的独特的OTU数量来估计细菌α-多样性；使用Spearman等级相关系数分析SDI与独特OTU数量的相关性；Cox比例风险模型；KM生存分析等

三、实验结果

01 - 16S rRNA基因扩增子测序解读肿瘤微生物多样性

        为了描述NSCLC的肿瘤微生物环境，对支气管镜（n = 28）和手术（n = 2）肿瘤活体组织以及健康肺部对照组织（n = 5）进行了16S rRNA基因扩增子测序。样本中可检测到来自不同门的细菌物种，可分配到 224 个单独的 OTU。 OTU 丰度范围从 <5000 reads到 >30000 reads，并且在 NSCLC 活检和健康肺样本中都显示出高比例的厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门（图1a）。在NSCLC活检中，观察到的独特OTU的数量（从3到109不等）与SDI高度相关，SDI是衡量α-多样性的既定标准，考虑到物种的数量和它们的丰度（图1b）。总之，结果表明，16S rRNA基因扩增子测序是一种在支气管镜NSCLC活检中分析细菌的合适方法，并表明肿瘤微生物栖息地的显著多样性以及病人之间的明显差异。

图1    通过16S rRNA基因扩增子测序揭示NSCLC肿瘤的微生物多样性

02 - 肿瘤微生物多样性较高患者的生存期获益

        分析分层患者组的SDI并未显示与性别、肿瘤分期或NSCLC组织学亚型有关（图2a-d）。同样，SDI在PD-L1低（0-20%）与PD-L1高（>20%）表达中具有可比性（图2e）。SDI不能根据患者对基于检查点的免疫疗法的放射反应[部分反应（PR）与稳定的疾病（SD）与进展的疾病（PD）]对其进行区分(图2f）。因此，SDI低与SDI高的患者之间的PFS是无区别的（图2g）。然而，SDI高的患者显示出明显更长的OS（图2h），这表明无论检查点免疫疗法的反应性如何，都能从较高的微生物多样性中获益。总之，肿瘤细菌宏基因组的多样性与ICI治疗的NSCLC的特定生存指标相关。

图2    肿瘤微生物多样性与NSCLC患者的生存率有关

03 - γ变形菌构成了NSCLC肿瘤微生物组的一个重要部分

        作者接下来试图研究哪些类型的细菌会在塑造或预测对PD-1/PD-L1靶向ICI的反应中发挥作用。如图3a所示，厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门在很大程度上占主导地位，共占检测到的肿瘤微生物组的近90%。其他仍显示出明显丰度的门类包括镰刀菌属和放线菌属（图3a）。Cox比例风险模型显示，在本研究队列中，只有变形菌门与PFS和OS明显相关，而γ变形菌类（占变形菌门的近60%，图3a）与生存率最显著相关（图3b）。总之，γ变形菌约占检测到的微生物组总数的7%，并与接受免疫疗法的NSCLC患者的生存率有关。

图3    在NSCLC肿瘤中含有大量的γ变形菌，并与患者的生存率有关

04 - γ变形菌与PD-L1低表达相关，并预测检查点免疫疗法的反应性差

        根据Cox比例风险模型的预测（图3b），作者分析了γ变形菌在分层患者亚群中的丰度，并比较研究了它们在健康肺部与NSCLC组织中的水平。虽然没有达到统计学意义，但与健康肺部对照组织相比，肺癌组织中的γ变形菌水平似乎更高（图4a）。根据性别、包数、肿瘤分期或NSCLC组织学亚型进行分层时，也未达到统计学意义（图4b-e）。相反，高丰度的γ变形菌与低PD-L1表达明显相关（图4f），这一发现也部分反映在对ICI治疗的反应上（PR vs. SD vs. PD）（图4g）。根据这些数据，肿瘤中γ变形菌丰度高的患者的PFS明显较差（图4h），OS也显示出类似的趋势，但未达到统计学意义（图4i）。综上所述，肺癌中似乎富含γ变形菌，它们在肿瘤周围的丰度与PD-L1低表达相关，在ICI治疗下，PFS较差，OS也有恶化的趋势。

图4    在ICI治疗下，γ变形菌与PD-L1低表达和患者生存率低有关

四、结论

        作者在此展示了基于16S rRNA基因扩增子测序的支气管镜肿瘤活检细菌鉴定的技术可行性，并报告了新型微生物特异性生物标志物在NSCLC中预后和检查点免疫疗法反应预测的鉴定。本研究概念验证研究为更大规模的验证试验奠定了基础，并推动了从机理上剖析潜在机制和定义治疗线索的努力。本研究报告了肿瘤环境中与微生物相关的新型NSCLC生物标志物，并强调了局部肿瘤微生物环境对ICI反应性和患者预后的重要性。