写在前面：正在准备课程pre，为了帮助自己理清逻辑，所以顺手把这篇文献翻译了。但是只翻译了对自己有用的部分（引言和讨论没有翻），若有需要还是请看原文。某些专业术语的翻译比较生硬，如有纰漏，欢迎批评指正。
文献：Patel, S., Sanjana, N., Kishton, R. et al. Identification of essential genes for cancer immunotherapy. Nature 548, 537–542 (2017) doi:10.1038/nature23477
一些名词：
sgRNA：single-guide RNA
EFT: effector function of T cells
2-CT-CRISPR assay: 2 cell type CRISPR
NY-ESO-1：某种肿瘤抗原
ESO T cell: 靶向NY-ESO-1抗原的T细胞
TCR：T cell recepter
E:T：effector to target ratio
CYT：cytolytic activity
ACT：adoptive cell transfer
HLA：human leukocyte antigen. HLA-A, HLA-B, HLA-C属于MHC-I 类分子
HR：Hazard ratio, 风险比率。风险比率是两个风险率（Hazard rate）的比值, 风险率是指单位时间内发生的时间数占被试总体的百分比。Kaplan-Meier曲线额能值观表示风险率。曲线上的点表示此时存活人数占全组人数的比值，即生存率。生存率与风险率之和为1。图中在任意一个时间点上，两个组的风险率之比，就是风险比率。
B2M：Beta-2 microglobulin
TAP：Transporter associated with antigen processing, 抗原处理相关转运蛋白
B2M和TAP都与MHC-I类分子的组装或呈递有关。
Fig.2 e
MOI：multiplicity of infection
背景知识：
NY-ESO-1
癌症种系（Cancer germline）抗原，是一类在多种肿瘤类型中表达的分子，但通常不表达于任何成人组织中，也不表达于缺乏HLA I类和HLA II类表达的生殖细胞之中，它是癌症治疗的有吸引力的靶点。
NY-ESO-1是一类CG抗原，在10% - 50%的转移性黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、甲状腺癌和卵巢癌以及70% - 80%的滑膜细胞肉瘤中表达。
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构建 2CT-CRISPR
为了鉴别与免疫细胞抗肿瘤作用的细胞类型或基因，作者对来自于接受了anti-CTLA4 antibody ipilimumab治疗的黑色素瘤患者的基因表达数据进行了相关性分析。
作者发现，瘤内的cytolytic activity(指标为穿孔素PRF1和颗粒酶GZMA的几何平均数) 与肿瘤内CD8+T细胞的增殖高度相关，也与有关MHC I类抗原加工/呈递通路的基因表达高度相关，但与IFN-γ信号基因弱相关。同时观察到病人总体生存率的减少与B2M和TAP1的表达下调（在接受iplimumab治疗前的肿瘤切片中）密切相关。
基于这些发现，作者选用了CD8+ T细胞和 MHC I 类基因来构建2-CT-CRISPR分析系统。CD8+ T cell经过基因改造，特异靶向以HLA-class I-restricted 方式表达的抗原（应该就是NY-ESO-1）==(?)==。作者使用慢病毒将重组TCR到原代T细胞中，这些TCR靶向NY-ESO-1抗原（ESO T cell）。这些T细胞此前已经报道可介导 melanomas和synovial cell sarcomas的肿瘤退化。
作者通过调节E:T和共培养时间来控制T细胞的选择压力和异常反应和bystander killing。为了测试在该2-CT array中，抗原呈递基因的缺失是否会直接减弱T细胞介导的人类癌细胞的细胞裂解，作者用三个sgRNA靶向TAP2和B2M，将它们克隆到了慢病毒中，再将慢病毒感染细胞。荧光激活细胞分选分析确定了B2M靶向的慢病毒CRISPR实现了约95%的蛋白knockout。
被转染了B2M sgRNA（72±5%）和TAP2 sgRNA（13±2%）的癌细胞对ESOT细胞展现出了显著的抗性。这些结果表示，在2CT-CRISPR筛选中，失去了关键的MHC I类基因会导致对T细胞介导的肿瘤杀伤的逃避。
- 使用2CT-CRISPR进行基因组水平的EFT筛选
为了从基因组水平鉴定肿瘤本身的EFT关键基因，作者用genome-scale CRISPR knockout（GeCKOv.2）文库转导了Mel624细胞（MOI<0.3）
GedKOv.2 文库含有123，411个sgRNA，靶向：19050个蛋白质编码基因（平均每个基因6个sgRNA）；1864个miRNA（平均每个miRNA有4个sgRNA）；1000个无靶向的sgRNA用于control。作者将转染过的肿瘤细胞与ESO T细胞混合了12h，E:T分别是0.3和0.5，结果分别是76%和90%的肿瘤细胞裂解。利用深度测序，作者检验了肿瘤细胞中的sgRNA 文库表达（分别在T细胞共培养之前和之后）。作者发现2CT-CRISPR array的效率依赖于T细胞的选择压力。
作者通过多种方式对候选基因的一致性富集进行了量化：①通过second-most-enriched sgRNA进行基因的排序；②RNAi 基因富集分析排序（RIGER）度量标准；③文库中富集在前5%的基因的sgRNA的数量==(?)==
三个方法展现出高度的overlap。
尽管E:T分别为0.3和0.5的两个扫描之间的富集sgRNA分布存在差异，但在不同扫描之间仍然共享一些高排名的基因和miRNA。在实验一开始对2CT-CRISPR进行优化时，作者设想与MHC I类抗原加工和呈递直接相关的基因会在扫描中富集，并发现HLA-A，B2M, TAP1, TAP2, and TAPBP基因会是扫描中最高富集的一批基因。但同时，作者也发现了许多此前没有发现与EFT有联系的基因也被也被排到了前20当中，比如SOX10, CD58, MLANA, PSMB5, RPL23 and APLNR 。
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假定为EFT关键基因的生物学功能
作者评估了2CT-CRISPR的最为富集的候选基因（共554个，假阳性率<0.1%），方法是候选基因与公共数据库上的的癌症基因组测序数据进行比较，同时观察这些候选基因与已知的癌症/免疫通路的关系。（下图示这554个基因被通过4种方法进行功能分析）
Inducibility by effector cytokines: effector机制的一部分是，T细胞在肿瘤微环境中通过分泌cytokine（如IFNγ）和肿瘤坏死因子α（TFNα）诱导转录调节，从而提高对肿瘤细胞的识别和裂解能力。为了评估这些被effector cytokine诱导的基因是否具有调节EFT的功能，作者取了cytokine-induced 基因的表达谱和候选基因的交集。他们发现13个IFNγ-induced 基因和3个 TNFα-induced 基因存在于554个top候选基因当中，支持了这些cytokine-induced 基因在肿瘤细胞EFT中的功能相关性。
Pathway enrichment: 通过基因ontology和通路分析，作者另外发现了筛查中富集的基因，除了在抗原呈递和IFNγ信号通路中发挥作用，还在EIF2信号通路、内质网应激反应、细胞凋亡、RNA多聚酶II的组装、TNF受体信号通路和蛋白质泛素化通路中发挥作用。这些数据揭示了肿瘤中未被分辨的信号通路系统，这部分信号通路的缺失可能会抑制EFT，值得深入研究。
Mutation frequency in cancer genomes: 为了评估在2CT扫描中鉴定出的基因的缺失，与病人肿瘤中细胞裂解的减少是否有关，作者从TCGA数据库中获取了11409个人类肿瘤（共包含36个癌症类型），并计算了候选基因和这些数据中的细胞裂解的相关性。该法获得了一系列基因，它与TCGA数据的每个癌症类型的细胞裂解有关，也在2CT扫描中被富集。
Associtation with intratumoral CYT: 通过分层聚类，作者鉴定出了19个基因, 它们在36个癌症类型中都与CYT相关
这19个基因中的10个可以被IFNγ诱导，表明这些基因可能由于T细胞的浸润增加而在癌细胞中上调表达。这19个基因在肿瘤中的不表达，可能diminish或extinguish: 肿瘤抗原呈递（包括HLA-A, HLA-F, B2M, TAP1, TAP2）；T细胞共刺激（ICAM1, CLECL1, LILRA1 和LILRA3）; 细胞因子合成和信号（JAK2, STAT1）。这些通路在肿瘤微环境中发挥作用，促进T细胞的浸润和激活，因此它们是免疫攻击中的主要机制。
作者在TCGA数据库的不同癌症类型中查看这些富集基因的突变频率。他们发现COL17A1、B2M、HLA-A、TAF3、DEFB134、ABR、QSER1和DHX9在不同恶性肿瘤的> 100个患者肿瘤中均发生突变，这表明这些候选基因的突变可在人类癌症中自然发生。
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top 候选基因的验证和泛化性
作者选择了17个基因作validation，这17个基因的选取标准如下：①基因应该至少在一个screen中排名前20；②这些基因在T细胞的抗肿瘤功能方面没有被描述过。作者同时囊括了CTAG1B（编码肿瘤抗原，NY-ESO-1）和TAPBP（编码参与了MHC I 类抗原加工的TAP相关蛋白），作为阳性对照。
作者重新设计了sgRNA，用4个sgRNA靶向NY-ESO-1+的melanoma cell，Mel624和A375的每个候选基因，并分别测量它们对ESO T细胞的抗性。
15个基因展现出了对T细胞介导的细胞裂解的显著抗性，这些细胞内至少含有一个sgRNA==(?)==。
为了消除对脱靶效应的顾虑，由至少2条不同的sgRNA引起的基因loss-of-function所造成的抗性表型，我们才认为它是EFT的关键基因。使用这些标准，作者确认了在Mel624和A375中都存在的候选基因。
转录因子SOX10在黑素瘤中的表达是其他癌症的16倍左右，并以2CT筛查中发现的其他基因（如MITF）为靶标，但它仅在Mel624细胞中得到验证，这可能是因为它在这些细胞中的表达比A375细胞高约1.8倍。
为验证这些被确认的基因能否泛化到一个无关的TCR抗原MART-1，作者将靶向这些基因的sgRNA转入了MART-1/MLANA+ 的Mel624细胞中，随后将它们于MART-1 TCR T细胞进行共培养。由于它们的高亲和力TCR和对癌症细胞的bystander destruction，MART-1 T细胞对肿瘤细胞具有很强的杀伤力。转导了作为对照的无靶向sgRNA的癌细胞在MART-1 T细胞培养基中被完全清除了，然而在相同的条件下，ESO T细胞只引起了约60%的癌细胞的裂解（这句话是在强调MART-1 T细胞的强杀伤力）。转染了靶向那9个候选基因的sgRNA的MART-1 Mel624细胞展现出了对相应T细胞的抵抗能力的提升。
作者通过对melanoma细胞的Cas9目标切割位点进行深度测序，确认了sgRNA的on-target gene disruption efficiency。在不同的melanoma细胞系和不同的抗原-TCR结合中证实的基因包括： cellular cytoskeleton genes, COL17A1 (collagen type XVII alpha 1) and TWF1 (twinfilin-1), a microRNA (hsa-mir-101-2) and a 60S ribosomal subunit (RPL23, Supplementary Discussion). 这些结果强调了在肿瘤细胞对EFT的调节中，这些生物学过程的功能的重要性。
随后，作者验证了由[ the cellular signalling-related genes APLNR, encoding a G-protein-coupled apelin receptor, and BBS1, encoding Bardet–Biedl syndrome 1 protein, and the adhesion-related gene CD58]的缺失引起的免疫耐受能否泛化到其他癌症类型。为此，作者使用逆转录病毒载体在患者来源的HLA-A* 02+肾细胞癌(2245R)细胞系中过表达NY-ESO-1 (CTAG1B)，并用4个sgRNAs靶向每个基因。对每个基因，APLNR, BBS1, CD58，至少2个sgRNA对ESO T细胞介导的细胞裂解展现出了> 50%的耐受能力。
总之，作者们用多种细胞系，靶抗原和癌症类型检验了在CRISPR中找到的关键基因。为了更好地理解此前并不了解的与EFT有关的一个基因，作者选择着重研究APLNR，它在不同细胞系和抗原中都得到了验证。
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APLNR的体内相关性
APLNR是一个G蛋白偶联受体，在几种癌症中都有突变。为了检验APLNR的功能丧失突变是否在接受了T cell-based 免疫治疗的病人中出现，作者挖掘一批全外显子组测序数据，这些数据来自接受了checkpoint blockade疗法（包括抗CTLA4，抗PD1抗体）的转移性melanoma和肺癌。从这些数据中，作者鉴别出了APLNR的7种错义突变，其中一个是无义突变（W261X），会导致7th的跨膜螺旋和受体的胞质羧基端的失去。
Ipi, ipilimumab; nivo, nivolumab; pembro, pembrolizumab;
CS, cytoplasmic signalling domain; EC, extracellular domain
APLNR的C末端含有对膜结合、受体内化、受体二聚化以及与胞质蛋白相互作用至关重要的残基，其缺失可能影响蛋白质功能。
作者还对从一名患者(SB-4044)身上切除的转移性肺病变进行了全外显子组测序，该患者患有耐受CTLA4 (ipilimumab)和抗PD1 (nivolumab)两种免疫疗法的黑色素瘤。样本中在APLNR上发现了两个错义突变，T44S和C181S（上图）。
作者从Van Allen et al. cohort 和 patient SB-4044 中选取了4个错义突变，以鉴别这些突变是否会减弱EFT。在APLNR-knockout A375细胞中，作者重新用慢病毒转入了突变的或野生型的APLNR。重新转入野生型APLNR，或者转入具有C181S或P292L突变的APLNR恢复了APLNR-knockout细胞对T细胞介导的细胞裂解的感知，而转入T44S和G349E突变的APLNR仅恢复了部分，这表明了APLNR的这些突变减弱了EFT。
这些功能丧失突变在无应答肿瘤病变中的出现，表明APLNR在肿瘤中的功能丧失与体内的免疫抑制有关。
为研究APLNR调节EFT的可能机制，作者用RNA-seq分析了APLNR-knockout细胞的转录组。然而，有关抗原呈递，T细胞抑制或共刺激的基因的mRNA转录水平并没有任何显著差异。因此，作者下一步考虑APLNR是否通过调节蛋白质signalling来调节EFT。已有报道称，APLNR可以与96种不同的细胞外蛋白质互作（BioGRID interaction database）,而且基因组范围的CRISPR筛查中，靶向同一个通路的多个基因可以导致相似的表型。 在这96个先前被报道的可以结合APLNR的蛋白质当中，JAK1是在本文的筛查中最富集的基因（富集于所有基因的前0.5%）
使用免疫沉淀pulldown，作者确认了在A375和HEK293T细胞中APLNR会与JAK1结合。
逆转录病毒过表达APLNR与JAK1蛋白水平的上升相一致。另外，APLNR的过表达也显著地增加了癌细胞对EFT的敏感性。
IFNγ驱动的JAK1的磷酸化激活了JAK-STAT信号级联反应，从而增强了肿瘤的抗原加工和呈递的能力，进而促进了T细胞的识别和细胞裂解能力。首先，作者检验apelin的处理是否可以直接诱导JAK1的磷酸化。但他们并没有观察到用apelin处理会诱发任何JAK1磷酸化。他们也检验了用多肽配体（ ([Pyr1]apelin 13, apelin 17 and apelin 36）或化学agonist（ML233）激活肿瘤细胞的APLNR是否可以改变EFT。他们也没有观察到这些操作能带来任何显著改变，这说明APLNR不通过典型的G蛋白欧联受体信号通路调节EFT。
下一步，作者检验了APLNR的缺失是否会改变癌细胞对添加IFNγ的反应。通过测量JAK1和STAT1的磷酸化状态和特殊的IFNγ应答基因的转录，作者发现APLNR-knockout细胞，当用IFNγ处理时，JAK-STAT信号通路的激发会减少。
与ESO T 细胞共培养6h后，相比于未受编辑的细胞，APLNR knockout细胞产生更少的β2M表达于细胞表面。
IFNγ会介导抗原加工和呈递的有关基因的表达上调，而APLNR-knockout细胞会减弱这一过程的敏感性。与该结论一致的是，作者观察到ESO T细胞对APLNR-knockout肿瘤细胞的识别能力显著下降。
总而言之，这些数据表明APLNR通过调节癌细胞IFNγ信号通路来增强EFT。
最后，为了在体内测试APLNR与免疫治疗的相关性，作者以多种sgRNAs靶向小鼠B16黑色素瘤的APLNR。同时囊括了靶向B2M的sgRNA作为阳性对照。
对于每个靶基因，作者对这些细胞进行了western blot，从而选择那些带来了最高的蛋白质减少量的sgRNA。在C57BL/6 immunocompetent小鼠皮下植入这些细胞后，作者没有观察到未处理的对照细胞和CRISPR修饰的细胞之间的肿瘤生长动力学有任何显著变化。然而，对这些肿瘤进行肿瘤特异Pmel TCR转基因T细胞（靶向melanoma 抗原 gp100）的过继性移植之后，这些肿瘤中的B2M knockout显著地减弱了过继性细胞转移（ACT）治疗的效果，该结果通过测量肿瘤细胞生长和宿主生存率得出。
类似地，对于APLNR-knockout肿瘤细胞，在ACT之后观察到了肿瘤清除能力和宿主生存率的显著减少。
作为与本文的基因组编辑B16肿瘤的一种正交方法，作者证实使用两个独立的发夹短发夹RNA (shRNA)介导的B16 APLNR敲除也降低了ACT的疗效。此外, 作者发现在B2905老鼠体内的黑色素瘤进行APLNR knockout （用sg-APLNR转导）会减弱anti CTLA4 blockade的效率，10只小鼠中有0只的肿瘤细胞完全消退；相比之下，10只小鼠中有5只小鼠（用 control sgRNA进行转导）的肿瘤细胞完全消退。综上所述,这些数据表明APLNR缺失减弱了T-cell-based癌症治疗的有效性,包括immune checkpoint blockade和ACT。