基因芯片（Affymetrix）分析1：芯片质量分析

• 芯片质量分析
• 芯片数据预处理
• 获取差异表达基因
• GO和KEGG分析
• 聚类分析

(本文于2013.09.04更新）

TAIR，NASCarray 和 EBI 都有一些公开的免费芯片数据可以下载。本专题使用的数据（Exp350）来自NASCarray，也可以用FTP直接下载。下载其中的CEL文件即可（.CEL.gz），下载后解压缩到同一文件夹内。该实验有1个对照和3个处理，各有2个重复，共8张芯片（8个CEL文件）。

为什么要进行芯片质量分析？不是每个人做了实验都会得到高质量的数据，花了钱不一定就有回报，这道理大家都懂。

芯片实验有可能失败，失败的原因可能是技术上的（包括片子本身的质量），也可能是实验设计方面的。芯片质量分析主要检测前者。

1 R软件包安装

使用到两个软件包：affy，simpleaffy。先获取biocLite函数并更新：

source("http://bioconductor.org/biocLite.R")
biocLite("BiocUpgrade")

更新后可能要重启R。如果以前曾经安装过Bioconductor的软件，可以直接调入BiocInstaller包而不必使用上面语句：

library(BiocInstaller)

执行下面语句安装affy和simpleaffy包：

biocLite(c("affy", "simpleaffy"))

另外还需要两个辅助软件包：tcltk和scales。tcltk一般R基础安装包都已经装有，使用它主要是考虑通用性，R基础包的choose.files和choose.dir等用户交互函数只有Windows才有，Linux和Mac没法使用。

install.packages(c("tcltk", "scales"))

2 读取CEL文件

载入affy软件包：

library(affy)
library(tcltk)

选取CEL文件。以下两种方法任选一种即可。

第一种方法是通过选取目录获得某个目录内(包括子目录）的所有cel文件：

# 用choose.dir函数选择文件夹
dir <- tk_choose.dir(caption = "Select folder")
# 列出CEL文件，保存到变量
cel.files <- list.files(path = dir, pattern = ".+\\.cel$", ignore.case = TRUE,
    full.names = TRUE, recursive = TRUE)
# 查看文件名
basename(cel.files)

## [1] "NRID9780_Zarka_2-1_MT-0HCA(SOIL)_Rep1_ATH1.CEL" 
## [2] "NRID9781_Zarka_2-2_MT-0HCB(SOIL)_Rep2_ATH1.CEL" 
## [3] "NRID9782_Zarka_2-3_MT-1HCA(SOIL)_Rep1_ATH1.CEL" 
## [4] "NRID9783_Zarka_2-4_MT-1HCB(SOIL)_Rep2_ATH1.CEL" 
## [5] "NRID9784_Zarka_2-5_MT-24HCA(SOIL)_Rep1_ATH1.CEL"
## [6] "NRID9785_Zarka_2-6_MT-24HCB(SOIL)_Rep2_ATH1.CEL"
## [7] "NRID9786_Zarka_2-7_MT-7DCA(SOIL)_Rep1_ATH1.CEL" 
## [8] "NRID9787_Zarka_2-8_MT-7DCB(SOIL)_Rep2_ATH1.CEL"

第二种方法是通过文件选取选择目录内部分或全部cel文件：

# 建立文件过滤器
filters <- matrix(c("CEL file", ".[Cc][Ee][Ll]", "All", ".*"), ncol = 2, byrow = T)
# 使用tk_choose.files函数选择文件
cel.files <- tk_choose.files(caption = "Select CELs", multi = TRUE, filters = filters,
    index = 1)
# 注意：较老版本的tk函数有bug，列表的第一个文件名可能是错的
basename(cel.files)

## [1] "NRID9780_Zarka_2-1_MT-0HCA(SOIL)_Rep1_ATH1.CEL" 
## [2] "NRID9781_Zarka_2-2_MT-0HCB(SOIL)_Rep2_ATH1.CEL" 
## [3] "NRID9782_Zarka_2-3_MT-1HCA(SOIL)_Rep1_ATH1.CEL" 
## [4] "NRID9783_Zarka_2-4_MT-1HCB(SOIL)_Rep2_ATH1.CEL" 
## [5] "NRID9784_Zarka_2-5_MT-24HCA(SOIL)_Rep1_ATH1.CEL"
## [6] "NRID9785_Zarka_2-6_MT-24HCB(SOIL)_Rep2_ATH1.CEL"
## [7] "NRID9786_Zarka_2-7_MT-7DCA(SOIL)_Rep1_ATH1.CEL" 
## [8] "NRID9787_Zarka_2-8_MT-7DCB(SOIL)_Rep2_ATH1.CEL"

读取CEL文件数据使用ReadAffy函数，它的参数为：

# Not run. 函数说明，请不要运行下面代码
ReadAffy(..., filenames = character(0), widget = getOption("BioC")$affy$use.widgets,
    compress = getOption("BioC")$affy$compress.cel, celfile.path = NULL, sampleNames = NULL,
    phenoData = NULL, description = NULL, notes = "", rm.mask = FALSE, rm.outliers = FALSE,
    rm.extra = FALSE, verbose = FALSE, sd = FALSE, cdfname = NULL)

除文件名外我们使用函数的默认参数读取CEL文件：

data.raw <- ReadAffy(filenames = cel.files)

读入芯片的默认样品名称是文件名，用sampleNames函数查看或修改：

sampleNames(data.raw)

## [1] "NRID9780_Zarka_2-1_MT-0HCA(SOIL)_Rep1_ATH1.CEL" 
## [2] "NRID9781_Zarka_2-2_MT-0HCB(SOIL)_Rep2_ATH1.CEL" 
## [3] "NRID9782_Zarka_2-3_MT-1HCA(SOIL)_Rep1_ATH1.CEL" 
## [4] "NRID9783_Zarka_2-4_MT-1HCB(SOIL)_Rep2_ATH1.CEL" 
## [5] "NRID9784_Zarka_2-5_MT-24HCA(SOIL)_Rep1_ATH1.CEL"
## [6] "NRID9785_Zarka_2-6_MT-24HCB(SOIL)_Rep2_ATH1.CEL"
## [7] "NRID9786_Zarka_2-7_MT-7DCA(SOIL)_Rep1_ATH1.CEL" 
## [8] "NRID9787_Zarka_2-8_MT-7DCB(SOIL)_Rep2_ATH1.CEL"

sampleNames(data.raw) <- paste("CHIP", 1:length(cel.files), sep = "-")
sampleNames(data.raw)

## [1] "CHIP-1" "CHIP-2" "CHIP-3" "CHIP-4" "CHIP-5" "CHIP-6" "CHIP-7" "CHIP-8"

3 查看芯片的基本信息

Phenotypic data数据可能有用，可以修改成你需要的内容，用pData函数查看和修改：

pData(data.raw)

##        sample
## CHIP-1      1
## CHIP-2      2
## CHIP-3      3
## CHIP-4      4
## CHIP-5      5
## CHIP-6      6
## CHIP-7      7
## CHIP-8      8

pData(data.raw)$Treatment <- rep(c("CK", "T1", "T2", "T3"), each = 2)
pData(data.raw)

##        sample Treatment
## CHIP-1      1        CK
## CHIP-2      2        CK
## CHIP-3      3        T1
## CHIP-4      4        T1
## CHIP-5      5        T2
## CHIP-6      6        T2
## CHIP-7      7        T3
## CHIP-8      8        T3

PM和MM查看：

# Perfect-match probes
pm.data <- pm(data.raw)
head(pm.data)

##        CHIP-1 CHIP-2 CHIP-3 CHIP-4 CHIP-5 CHIP-6 CHIP-7 CHIP-8
## 501131  127.0  166.3  112.0  139.8  111.3   85.5  126.3  102.8
## 251604  118.5  105.0   82.0  101.5   94.0   81.3  103.8  103.0
## 261891  117.0   90.5  113.0  101.8   99.3  107.0   85.3   85.3
## 230387  140.5  113.5   94.8  137.5  117.3  112.5  124.3  114.0
## 217334  227.3  192.5  174.0  192.8  162.3  163.3  235.0  195.8
## 451116  135.0  122.0   86.8   93.3   83.8   87.3   97.3   83.5

# Mis-match probes
mm.data <- mm(data.raw)
head(mm.data)

##        CHIP-1 CHIP-2 CHIP-3 CHIP-4 CHIP-5 CHIP-6 CHIP-7 CHIP-8
## 501843   89.0   88.0   80.5   91.0   77.0   75.0   79.0   72.0
## 252316  134.3   77.3   77.0  107.8   98.5   75.0   99.5   71.3
## 262603  119.3   90.5   82.0   86.3   93.0   89.3   94.5   83.8
## 231099  123.5   94.5   76.5   95.0   89.3   87.8   95.5   91.5
## 218046  110.3   93.0   74.8  100.5   86.0   89.5  104.5  102.3
## 451828  127.5   77.0   80.3   94.5   72.3   79.0   86.3   67.8

4 显示芯片扫描图像（灰度）

# 芯片数量
n.cel <- length(cel.files)
par(mfrow = c(ceiling(n.cel/2), 2))
par(mar = c(0.5, 0.5, 2, 0.5))
# 设置调色板颜色为灰度
pallette.gray <- c(rep(gray(0:10/10), times = seq(1, 41, by = 4)))
# 通过for循环逐个作图
for (i in 1:n.cel) image(data.raw[, i], col = pallette.gray)

如果芯片图像有斑块现象就很可能是坏片。

5 对灰度值做简单统计分析

5.1 箱线图

par(mfrow = c(1, 1))
par(mar = c(4, 4, 3, 0.5))
par(cex = 0.7)
if (n.cel > 40) par(cex = 0.5)
# rainbow是R的一个函数，用于产生彩虹色
cols <- rainbow(n.cel * 1.2)
boxplot(data.raw, col = cols, xlab = "Sample", ylab = "Log intensity")

5.2 histogram曲线

par(mar = c(4, 4, 0.5, 0.5))
hist(data.raw, lty = 1:3, col = cols)
legend("topright", legend = sampleNames(data.raw), lty = 1:3, col = cols, box.col = "transparent",
    xpd = TRUE)

6 MA-plot分析

par(mfrow = c(ceiling(n.cel/2), 2))
par(mar = c(3, 3, 2, 0.5))
par(tcl = 0.2)
par(mgp = c(2, 0.5, 0))
require(scales)
col <- alpha("seagreen", alpha = 0.01)
MAplot(data.raw, col = col, loess.col = "red", cex = 0.9)

IQR差别大的芯片可能有问题，但芯片能不能用得看具体情况（参考其他指标）而定。

7 RNA降解分析

par(mfrow = c(1, 1))
par(mar = c(4, 4, 3, 0.5))
RNAdeg <- AffyRNAdeg(data.raw)
summaryAffyRNAdeg(RNAdeg)

##          CHIP-1   CHIP-2   CHIP-3  CHIP-4   CHIP-5   CHIP-6   CHIP-7
## slope  1.71e+00 1.67e+00 1.82e+00 1.9e+00 1.60e+00 1.73e+00 1.72e+00
## pvalue 2.31e-10 5.11e-11 4.74e-11 3.0e-11 2.84e-11 3.39e-12 1.31e-10
##          CHIP-8
## slope  1.61e+00
## pvalue 7.84e-11

plotAffyRNAdeg(RNAdeg, cols = cols)
legend("topleft", legend = sampleNames(data.raw), lty = 1, col = cols, box.col = "transparent",
    xpd = TRUE)
box()

理想状况下各样品的线（分段）是平行的。从上面图上看芯片1可能有点问题。

8 用simpleaffy包进行分析

library(simpleaffy)
# 计算芯片质量数据
qc.data <- qc(data.raw)
# 平均背景值，如果太大则表示可能有问题
(avbg.data <- as.data.frame(sort(avbg(qc.data))))

##        sort(avbg(qc.data))
## CHIP-8               60.74
## CHIP-5               63.53
## CHIP-2               63.71
## CHIP-3               63.92
## CHIP-7               63.92
## CHIP-6               66.59
## CHIP-1               78.95
## CHIP-4               79.61

# 样品的scale factor
(sfs.data <- sort(sfs(qc.data)))

## [1] 0.5689 0.6235 0.6905 0.6920 0.7660 0.8179 0.8191 0.8386

# affy建议每个样品间的sf差异不能超过3倍
max(sfs.data)/min(sfs.data)

## [1] 1.474

# 表达基因所占的比例，太小则表示有问题
as.data.frame(percent.present(qc.data))

##                percent.present(qc.data)
## CHIP-1.present                    58.27
## CHIP-2.present                    62.10
## CHIP-3.present                    62.98
## CHIP-4.present                    60.95
## CHIP-5.present                    58.02
## CHIP-6.present                    59.35
## CHIP-7.present                    62.66
## CHIP-8.present                    62.30

# 内参基因的表达比例
ratios(qc.data)

##        actin3/actin5 actin3/actinM gapdh3/gapdh5 gapdh3/gapdhM
## CHIP-1        0.3860     -0.297736        0.3118       -0.9426
## CHIP-2        0.3999     -0.179446        0.3333       -0.6741
## CHIP-3        0.3891     -0.005161        0.5414       -0.7286
## CHIP-4        0.4889     -0.152291        0.5449       -0.7081
## CHIP-5        0.2049     -0.348223        0.4260       -0.6383
## CHIP-6        0.4554     -0.039076        0.2426       -0.8057
## CHIP-7        0.5528     -0.226408        0.4426       -0.5121
## CHIP-8        0.4545     -0.152246        0.2308       -0.8548

9 代码的运行环境（Session Info）

sessionInfo()

## R version 3.0.1 (2013-05-16)
## Platform: x86_64-pc-linux-gnu (64-bit)
## 
## locale:
##  [1] LC_CTYPE=zh_CN.UTF-8       LC_NUMERIC=C              
##  [3] LC_TIME=zh_CN.UTF-8        LC_COLLATE=zh_CN.UTF-8    
##  [5] LC_MONETARY=zh_CN.UTF-8    LC_MESSAGES=zh_CN.UTF-8   
##  [7] LC_PAPER=C                 LC_NAME=C                 
##  [9] LC_ADDRESS=C               LC_TELEPHONE=C            
## [11] LC_MEASUREMENT=zh_CN.UTF-8 LC_IDENTIFICATION=C       
## 
## attached base packages:
## [1] parallel  tcltk     stats     graphics  grDevices utils     datasets 
## [8] methods   base     
## 
## other attached packages:
##  [1] simpleaffy_2.37.1     gcrma_2.33.1          genefilter_1.43.0    
##  [4] scales_0.2.3          ath1121501cdf_2.12.0  AnnotationDbi_1.23.18
##  [7] affy_1.39.2           Biobase_2.21.6        BiocGenerics_0.7.4   
## [10] zblog_0.0.1           knitr_1.4.1          
## 
## loaded via a namespace (and not attached):
##  [1] affyio_1.29.0         annotate_1.39.0       BiocInstaller_1.11.4 
##  [4] Biostrings_2.29.15    colorspace_1.2-2      DBI_0.2-7            
##  [7] dichromat_2.0-0       digest_0.6.3          evaluate_0.4.7       
## [10] formatR_0.9           highr_0.2.1           IRanges_1.19.28      
## [13] labeling_0.2          munsell_0.4.2         plyr_1.8             
## [16] preprocessCore_1.23.0 RColorBrewer_1.0-5    RSQLite_0.11.4       
## [19] splines_3.0.1         stats4_3.0.1          stringr_0.6.2        
## [22] survival_2.37-4       tools_3.0.1           XML_3.98-1.1         
## [25] xtable_1.7-1          XVector_0.1.0         zlibbioc_1.7.0

---

Author: ZGUANG@LZU

Created: 2013-09-04 三 13:18