Nat Biotech | 光遗传控制RNA定位、剪接、翻译和稳定性
原创 风不止步 图灵基因 2022-01-15 07:03
收录于话题#前沿分子生物学技术
撰文：风不止步
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亮点：
一种可光转换的RNA结合蛋白（RBP），在蓝光照射下与特定的RNA序列结合的LicV工程，可光控的RBP LicV可以作为一个可编程的支架，用于合成RNA效应物的时空控制。辅助的CRISPR-Cas系统允许对转录和基因组位点标记进行有效和可调控的光开关调节。
2022年01月03日，我国华东理工大学的杨毅教授等人在《Nature Biotechnology》上发表了一篇“Optogenetic control of RNA function and metabolism using engineered light-switchable RNA-binding proteins”的文章，文章描述了LicV的工程，它是一种可光转换的RNA结合蛋白（RBP），在蓝光照射下与特定的RNA序列结合。当与各种RNA效应器融合时，LicV可以在细胞培养中对RNA的定位、剪接、翻译和稳定性进行光遗传控制。
RNA在细胞内的特定时间和地点表现出复杂的动态和功能，这些动态包括其表达、降解、易位、拼接和其他化学修饰的变化；因此，能够精确和时空操纵RNA动态和功能的技术对于理解活细胞中RNA的生理功能是非常可取的。一些研究试图通过使用紫外光激活化学诱导的RNA来控制RNA的功能；这些努力允许对基因表达、核酸酶活性、CRISPR-Cas功能和蛋白质-RNA交联进行光学控制。然而，生物学家对这些方法的接受程度是有限的，可能是因为紫外线辐射的毒性和笼式RNA合成相关的技术复杂性。另外，RNA的功能可以通过基因编码的光开关RBPs来进行光遗传控制。光遗传学是一种新兴的技术，其中基因编码的光开关蛋白被用来操纵生物过程，具有不可超越的灵活性和高时空精度。在真核细胞中，许多蛋白质被认为具有RBPs的功能，它们管理着RNA代谢的几乎所有方面，包括转录、加工、翻译、周转和细胞定位。然而，关于天然光可转换RBPs的报道极为罕见。
图1：工程化的光开关RBP
最近，Weber等人选择了一种能够以光依赖的方式特异性地结合PAL这一天然蓝光受体的RNA适配体。光激活的PAL-RNA相互作用被证明能够在细菌和哺乳动物细胞中进行翻译抑制。假设合成的光可转换的RBPs，也可以从天然的RBPs和光感受器中设计出来。此前，作者和其他人开发了几种光可转换的DNA结合蛋白（DBPs）和光遗传转录控制系统，在这些系统中，由一种光可转换的DBP控制的单组分系统似乎更受欢迎，因为它们具有简单和大开/关比率的优点。这些光可转换DBP是基于简单的模块设计，由一个DNA结合域和一个小型的含光氧电压（LOV）域的蛋白质组成。暴露在蓝光下后，可光控DBPs的低聚状态和结合能力被改变为与其相匹配的DNA序列，这直接导致了基因转录的激活或压抑。因此，假设用RNA结合图案替换光敏DBPs中的DNA结合图案将创造出光敏RBPs，这可能是研究RNA生物学的宝贵光遗传学工具。
图2：用于光遗传学控制RNA代谢过程的合成光开关效应物。
文章表明，LicV是开发合成效应器的极佳支架，可以对RNA的定位、剪接、翻译和稳定性进行时空控制。在未来，控制RNA表观遗传学的光遗传学工具可能通过融合LicV来写入或删除RNA甲基化的功能而被设计出来。此外，LicV与PAL的结合提供了一个对不同RNA的功能进行不同和正交控制的机会，这对研究具有拮抗或协同功能的RNA特别有用。与PAL相比，LicV要小得多，其开/关比率明显更大，在控制RNA功能方面显示出更广泛的应用范围。用于开发LicV的方法将来可能被应用于其他RNA结合结构域和对不同波长的光有反应的光敏蛋白。正交光敏RBPs及其同源的RNA适配体将扩大光敏RBPs在生物学研究中的应用，允许同时调节多种RNA的功能，以更好地了解复杂的生物过程。特别是对红光或红外光有反应的光开关RBPs工程将更适合于在体内触发RNA分子，因为在这个范围内的光具有卓越的深层组织穿透特性。
图3：LA-CRISPR系统对转录的高效和可调控的激活。
值得注意的是，LicV作为CRISPR-Cas系统时空调控的一种前所未有的简单通用方法。CRISPR-Cas工具箱由许多具有独特性质的Cas蛋白组成，包括裂解的DNA末端（内聚或钝化）、PAM偏好、目标特异性和底物类型（DNA或RNA），被广泛用于DNA和RNA的编辑、检测和成像。对有限的CRISPR-Cas系统的光介导操纵可能通过光诱导的Cas蛋白和效应域的异源二聚体或Cas蛋白的分裂两半来实现，通过恢复笼式Cas蛋白或间接通过光可转换的抗CRISPR蛋白的工程。所有这些系统都需要对特定的Cas蛋白进行复杂而耗时的蛋白质工程，并且/或者涉及多个组件。相比之下，LA-CRISPR系统依靠的是对RNA功能的控制。LicV靶向sgRNAs容易设计，而且相当小（<500核苷酸），消除了工程相当大的Cas蛋白（>3,600 nt）的复杂性。这种简单的设计和LA-CRISPR的广泛适用性对新发现的Cas蛋白特别有用。LA-CRISPR系统具有信号放大的额外优势，因为它们允许通过LicV和RAT之间的相互作用在蓝光照射后招募多个基于LicV的效应器到sgRNA。这种放大效应和增强的灵敏度对转录激活和成像很有帮助，已经在组成型活性RNA拴系系统和蛋白质拴系系统得到了证明。此外，LA-CRISPR系统允许在不同强度的LicV信号存在或不存在的情况下，使用一个Cas蛋白和多个sgRNAs同时但有区别地对不同的细胞活动进行光开关控制。
图4：利用LA-CRISPR系统对基因组位点标记的光遗传控制。
此外，LA-CRISPR系统与目前基于Cas蛋白的蛋白-蛋白相互作用的可光控CRISPR-Cas系统是正交的，这为它们的联合使用提供了机会，从而在灵敏度和多功能性方面得到进一步的提高。在未来，将有可能利用光来异位控制带有RAT序列插入的sgRNA的结构、它们与Cas9蛋白的结合以及通过光诱导LicV与RAT的招募将Cas复合物招募到DNA目标，这可能会减少Cas蛋白永久停留在DNA上引起副作用的可能性，例如，基因组组织和动态的扰动。预计LA-CRISPR系统将允许实现更多的应用，如基因沉默的光遗传控制、基因组编辑以及内源性RNA的控制和成像。
教授介绍
杨毅教授
该研究员的研究领域是生物化学和细胞生物学、合成生物学和化学生物学。研究重点是活细胞的荧光成像和光遗传学操作方法，及其在生物制造、遗传和药物筛选中的应用。
主要项目包括：
用于细胞代谢物和生命活动的基因编码传感器：目前正在通过融合荧光蛋白和特定传感域来开发基于蛋白质的传感器，这些传感器可以方便地用于监测各种细胞内事件。
活细胞中蛋白质和RNA的基因编码标记：荧光蛋白彻底改变了体内蛋白质的研究。然而，没有类似于用于 RNA 的荧光蛋白的强大工具。正在开发荧光 RNA，当它们与非荧光染料结合时会变得高度荧光。还致力于研究具有扩展光谱和快速成熟速度的合成荧光蛋白，以替代天然荧光蛋白。
用于蛋白质硫醇翻译后修饰的特异性标记和成像的小分子荧光探针，包括蛋白质 S-亚硝化、二硫化物、次磺酸和邻位二硫醇。为细胞蛋白二硫化物、S-亚硝化、次磺酸和邻位二硫醇开发了新的荧光成像方法。正在进行的研究包括蛋白质硫醇蛋白质组的调节及其功能影响。
光遗传学模块和电路。目前正在开发可被光激活的合成蛋白质。这些蛋白质可用于以时空方式控制基因表达、酶催化以及活细胞和动物的标记。
高内涵、高通量遗传和药物筛选：新方法使鉴定大规模调节全球细胞代谢的基因和化学物质成为可能，这些基因和化学物质有可能用于疾病诊断和治疗。
蛋白质表达系统和生物制造技术：目前正在致力于提高效率并减少排放的下一代生物反应器技术。
参考文献
Renmei Liu, Jing Yang et al.Optogeneticcontrol of RNA function and metabolism using engineered light-switchableRNA-binding proteins.(2022)