易基因 | 表观技术：染色质结构构象与DNA互作：ChIP-seq、ATAC-seq

今天一起来聊聊关于染色质结构构象与DNA互作的常用检测技术：ChIP-seq和ATAC-seq。

1、染色质免疫共沉淀测序技术（ChIP-Seq）

染色质免疫共沉淀(Chromatin

Immunoprecipitation,ChIP)，是研究体内蛋白质与DNA相互作用的经典方法。将ChIP与高通量测序技术相结合的ChIP-Seq技术，可在全基因组范围对特定蛋白的DNA结合位点进行高效而准确的筛选与鉴定，为研究的深入开展打下基础。

不同组蛋白的差异性修饰与基因的转录、染色质的空间构型和构象密切相关。运用某一修饰的特定组蛋白的特异性抗体富集与其结合的DNA片段，并进行纯化和文库构建，然后进行高通量测序，通过将获得的数据与参考基因组精确比对，研究人员可获得全基因组范围内某种修饰类型的特定组蛋白与基因组DNA序列之间的关系，也可对多个样品进行差异比较。

技术优势：

（1）筛选范围广：全基因组范围内筛选特定组蛋白修饰与基因组DNA序列之间的关系

（2）微量样本：只需5ng以上免疫沉淀后的DNA，即可展开测序分析

（3）方案灵活：根据不同的项目需求，选择不同的组蛋白修饰特异性抗体

研究案例：

组蛋白修饰与改变抗原特异性T细胞应答有关

XM Yang，et al.(2014) Histone modifications areassociated with Delta(9)-tetrahydrocannabinol-mediated alterations in antigen-specificT cell responses.J Biol Chem. 2014 May 19. pii: jbc.M113.545210.

背景：

大麻是一种毒品，但是它也可以用作药用，在大麻的成分中，Δ9四氢大麻酚还有消炎药的功效，Δ9四氢大麻酚的免疫调节是否受到表观因素的调控以前还没有研究过。

方法：

利用ChIP-Seq技术研究组蛋白修饰在Δ9四氢大麻酚介导的抗原特异性T细胞应答中的变化。这里用到的抗体共五种，包括H3K4, H3K27, H3K9,H3K36 tri-methylation和H3K9ac。

结论：

结果显示，很大部分组蛋白的甲基化和乙酰化的区域都被THC（Δ9四氢大麻酚）改变了，THC激活一部分的基因，同时又会通过组蛋白调节抑制另一部分基因的表达。这些组蛋白标记相关的功能聚类分析显示这些不同的相关的基因和各种细胞功能有关，从细胞周期调节到新陈代谢，THC通过调节组蛋白修饰来调节免疫反应。

淋巴节点细胞中H3组蛋白的分布       激活淋巴节点细胞中H3组蛋白甲基化区域的分布

2、转座酶可接近核染色质（ATAC-seq）

ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing）是通过使用高通量测序对转座酶可接近性核染色质区域进行分析的一种创新表观遗传学研究技术。该技术通过转座酶对某种特定时空下开放的核染色质区域进行切割，进而获得在该特定时空下基因组中所有活跃转录的调控序列。

真核生物的DNA并不是裸露的，而是被包装成核小体形成串珠状结构并进一步被折叠、包装。而基因的转录，需要将这种高级结构解开，使DNA成为可以使各种转录机器与其结合的裸露状态，即形成开放染色质区域。如何鉴定开放染色质区域呢？传统的方法主要是借助和DNase-Seq、MNase-Seq及ChIP-seq。但这些方法需要的起始细胞量较大，对于少量样本和珍稀样本可行性不高。ATAC-Seq是一种新型的研究开放染色质的技术，利用Tn5转座酶进入并切割裸露的DNA，并同时连接上特异性的测序接头。因为切割和加接头一步完成，因此该技术可大大降低所需细胞起始量。

技术优势：

（1）所需细胞起始量低。

（2）应用范围广，适用于大部分物种及细胞类型。

研究案例:

ATAC-seq分析显示年龄相关性黄斑变性患者的染色质可及性普遍降低

Wang J, Zibetti C,Shang P, et al. ATAC-Seq analysis reveals a widespread decrease of chromatinaccessibility in age-related macular degeneration[J]. Nature Communications,2018, 9(1).

背景：

年龄相关性黄斑变性（AMD）是导致老年人视力丧失的主要因素，大多发生于45岁以上，其患病率随年龄增长而增高。目前AMD进程中表观遗传的改变尚不清楚。本文利用ATAC-Seq对AMD患者视网膜（retina）及视网膜色素上皮细胞（RPE）进行染色质易近性进行了研究。

方法：

利用ATAC-Seq技术鉴定AMD及正常组织的retina及RPE的开放染色质区域。另外，结合RNA-Seq技术对开放染色质区域与基因表达的关系进行分析。

结果：

将鉴定出的peak（开放染色质区域）分类得到retina特异、RPE特异及两者共有的peak，与不同组织比较（DNase-Seq数据），发现两者共有的peak大部分是组织特异的，retina及RPE特异的peak大多是组织特异的（下左图）。利用peak将样本分类，发现retina和RPE明显分开，正常组织和AMD也有分离的趋势（下右图）。

分别鉴定retina和RPE AMD早期vs正常组织以及AMD晚期vs AMD早期的差异开放染色质区域（AMD），表明retina染色质易近性主要在AMD早期到AMD晚期出现下降，而RPE染色质易近性主要在正常组织到AMD早期出现下降（下左图）。结合转录组分析表明，ATAC-Seq peak强度和基因表达呈现较强相关性，相关系数为0.51（下右图）。