10x Genomics RNA-seq 原理详解

近期的一系列际遇都再次论证了我真的是一个靠运气闯荡江湖的人，鬼使神差的混入了一个超棒的实验室，并且受到了同伴和室友在工作和生活上的无私的照顾。日子像梦一样美好，我只想时间走的再慢一点，让我能把这里的四季再多看一眼，再看清楚一些。
记得之前果子老师说过，靠输出倒逼输入，我想尝试着把我的学习过程记录下来，理清思路，同时也许还能认识更多的再学习路上的小伙伴。（我真的考大学都没有这么努力过，倒着时差学习，哈哈）

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就从这篇最经典的Drop-seq文章开始吧。
Russell 告诉我，这篇文章只需要看懂前两个图，我们来看看它们讲了什么。
图一（本文的图一，文章中的图二）

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我来尝试以我的思路讲清楚它。
无论出于什么原因，你希望能够测到一个cell里面的转录组（transcriptome），根据illumina的测序仪，你是不可能在最后一步一个细胞一个细胞单独测的（我了解的不多，不知道这句话是否正确），所以一个正常的思路是，给每一个细胞一个单独的标记，并且，希望在标记的过程中每一个细胞都是分开的，并且不会互相接触到，这行在标记的过程中，才不会混。
那么，我们如何实现这个过程呢？
首先，为了保证你的细胞在标记的过程中是分开的，这波人发明了一个叫做微流体设备的东西（microfuidic device）
里面有三个上样孔，在其中你可以分别加入1、你的样本细胞悬液，2、Gel Beads 3、partitioning oil。像下图中一样。

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然后它就可以启动图一A中的流程，当细胞流过时，会被与beads结合然后被油滴包裹，形成一个油包水的密闭小液滴（droplet）。细胞和microparticle（beads）相遇会裂解，释放出里面的各种物质，RNA（mRNA，tRNA，rRNA），蛋白质，脂质，DNA等等各种物质。因为beads上联接了接头，其中有一段是ploy （dT）序列（30）个，在细胞裂解释放的核酸中，只有mRNA带有polyA的尾巴，于是这段beads上面ploy （dT）就可以从众多的裂解产物里捕获到mRNA。这也就是Russell问我为什么Drop-seq要用3'端测序的原因了。
Maxter Mix中带有反转录试剂，当mRNA被捕获后，就可以从它的3‘端开始作为模板，进行反转录出cDNA的第一条链，这第一条链就沿着poly（dT）序列延申，长在了beads上，形成了图一7中的STAMPs，接着我们把序列洗脱，以cDNA的第一条链为模板，进行PCR，合成cDNA的第二条链，然后就是我们熟悉的（我其实不熟悉，哈哈）cDNA扩增，illumina测序啦。
我们如何知道那些序列是来自那个细胞的？或者说，single cell的RNA-seq和bulk的RNA-seq的最大区别在哪里呢？是Barcode，或者说是Cell barcode。每一个beads上都有着相同的Cell barcode，而beads与beads间的Cell barcode是不同的，假设每个beads只捕获一个cell，那么则每个cell都被cell barcode 单独标记了。
如何保证每一beads只捕获一个cell呢？第一是控制cell和beads的流速，第二是beads的数目远远超过cell的数目，即绝大多数的beads都是空的，只有少数的才捕获到了cell。但是还是有个别的droplet里面会两个或者更多的细胞，这就需要我们去QC啦。
single cell RNA-seq的barcode这么神奇，我们结合10x Genomics的说明书一起来分步骤详解一下。

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先来看看这些区段都是用来做什么的。
由内向外：
Poly（dT）：用来和polyA结合，捕获mRNA
UMI：用来标记不同的PCR产物（数count）
10xBarcode：用来标记不同的细胞
Sample Index：用来标记不同的样本
Truseq Read 1、2 ：用来进行连接beads，cDNA的PCR扩增和加P7接头
P5和P7：用来进行illumina的桥式PCR测序。
在这些序列中，P5、P7、Read 1、2 的序列是已知的
和beads上连接的序列最开始只有Read1 ，10x Barcode，和poly（dT），其他的这些接头是怎样一步步加上，并且发挥作用的？10xGenomics的说明书上给了具体步骤。我看下来，觉得最主要的思想，就是用已知的序列设计引物，PCR出未知的序列。

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利用Poly（dT）来捕获mRNA，反转录出cDNA的第一条链，并且在cDNA的末端加上CCC序列，和TSO序列的GGG序列互补，并以TSO序列为模板，继续延申。这其实很重要，因为中间cDNA的序列我们是不知道的，如果不加上这个接头，就没有办法设计引物，合成cDNA的第二条链。

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对TSO序列和Read1 设计引物，合成cDNA的第二条链，并完成cDNA的扩增。

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因为II代测序illumina测序不能测很长，约为200-700bp，所以不能测得mRNA全长，所以会把合成的cDNA利用酶打断到illumina能测的长度，然后再两边加上接头，Read2。 设计部分与Read1和Read2重叠的引物，加上P5，P7和sample index，就可以去进行illumina测序了。

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我画了一张图（homework，哈哈），加上了序列，用来弄清楚这个过程。
下一步是再看一遍说明书，对着这个过程，弄懂每个操作是在干什么。
小刀老师说：好好学习，天天向上啊！