引物合成原理及纯化方式选择

引物合成过程

  寡核苷酸（后面简称引物）的制备是通过使用 DNA 合成仪完成的，合成仪本质上是一套由计算机控制的试剂递送系统。第一个碱基将会被连接至固体支持物（通常是玻璃或聚苯乙烯微珠），该支持物旨在锚定反应柱中不断延长的 DNA 链。DNA 合成由一系列的化学反应所组成，不同于酶促的DNA合成过程从5'→3'方向延伸，而是由3'→5'方向进行。

1. 解封：第一个碱基通过糖环上的3'-OH与固体支持物相连，其糖环上的5'-OH被4,4'-二甲氧基三苯甲基（DMTr）封闭，合成循环的第一步就是去除保护基团，生产一个游离的 5’-OH 基团，以便与下一个碱基进行反应。

2. 活化：将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体 (其3'-端已被活化，但5'-端仍受DMT保护)，此中间体将与GPG上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。

3. 偶联：携带亚磷酰胺四唑活性中间体的碱基（由亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合形成的中间体）与第一个碱基偶联，从而加入新的核苷酸，偶联失败的产物就会形成短片段。这一步是引物链增长的过程，是整个循环中最关键的一步。

4. 戴帽：上一步反应中，未能加入新碱基的活化碱基被醋酸酐酰化，这一步称为戴帽，这些戴帽的碱基在不会参与到后续的合成循环中。这一步是非常必要的，如果没有这个过程，下个循环中错误的碱基就会掺入，影响引物的准确性和纯化。

5. 氧化：通过氧化剂，第一个碱基与被成功偶联的第二个碱基之间的亚磷酯键将会被氧化成稳定的磷酸三酯键，以维持不断增长的链。
6. 氧化完成后，清除新加入碱基5'端DMTr保护基团，开启新一轮的循环。这样循环往复，每个反应循环都会加入一个 DNA 碱基，通过控制循环数即可达到期望长度的DNA引物。最后，引物链从固体支持物上切除，再清除引物的保护集团，通过脱盐和纯化即可得到目标产物。

有些实验员还搞不清楚引物5'端到底有没有磷酸基团，从第6步的过程看，最后一个碱基5'端DMTr保护基团清除后，暴露出来的是5’-OH，是没有磷酸基团的，不能够直接用于3'-5'连接反应，这是合成方法本身局限的，如果你需要带5'端磷酸的引物，就需要告诉合成公司进行修饰，也可以自己用磷酸化酶处理。

引物合成的副产物

  所有的化学反应都不是100%进行的，即使是最彻底的中和反应也是处于动态平衡的，那么引物合成过程中会产生那些干扰呢？下面我们来看看，反应不彻底会产生什么样的影响？

①假设我们要合成ATCG，A首先固定在固相载体上；
②然后解封、活化、偶联上T，这时假设有X的T被偶联上，那么就有(1-X)的A被加帽封闭了，如果加帽的效率为Y，就有(1-X)(1-Y)的A仍处于5'-OH状态，本轮循环结束，产生X的AT，(1-X)Y的A（封死），(1-X)(1-Y)的A（活化态）；
③继续下一轮：X的AT中继续有X偶联上C产生X²的ATC，X(1-X)Y的AT（封死），(1-X)(1-Y)的AT（活化），更严重的是上一步未封死的A（(1-X)(1-Y)）会被加上C，产生X(1-X)(1-Y)的AC错误引物，虽然这个概率是极低的，但是引物总量巨大，你可能正好用到错误的碱基，得到了错误的扩增结果；
……
④最后共产生ATCG、ATC、AT、A、AC、ATG等多种产物，其中
的ATCG的比例为X³，A的比例为1-X，AT的比例为X(1-X)，ATC的比例为X²(1-X)，A、AC、ATG可以忽略（仍有发生的可能性，发生这种情况也只能说明你的运气实在差到了极点）。
⑤以此类推，要合成长度为n的引物，就会不可避免的产生1~n-1的短片段，全长产物的比例为X^n-1，长度为m的短片段的比例为（1-X）*X^m-1的短片段。
⑥最后，产物从载体上切离，去保护基团，但是碱基不能100%脱保护，即引物上可能含有残留保护基团，通常发生在G转换成其它碱基。碱基G在一定条件下可以转化为烯醇异构体2,6-diaminopurine（脱嘌呤），DNA复制和PCR过程中DNA聚合酶将2,6-diaminopurine看作碱基A，发生G到A的转换，测序就会发现碱基G-A置换。脱嘌呤现象在富含嘌呤的引物中发生的频率较高。

  引物合成过程中，会产生各种各样的副产物，大多数副产物基本可以忽略，但短片段的比例是不容忽视的，一般的偶联步骤效率在99%左右，25nt的引物，全长的比例=0.99²⁴=78.6%，每种短片段的比例接近0.99%，一般PCR体系中，引物的使用浓度为0.2-0.5uM，这样的浓度下短片段的数目也是很大的，这些短片段可能结合在非目的区，往往导致非特异条带的产生，甚至克隆失败。为了避免这种缺陷，引物合成之后需要对应的纯化步骤，去除小片段，这对较高要求的PCR和分子克隆是十分必要的。

引物纯化方式

• DSL（脱盐）纯化
    又称为简易反相柱，柱子特异性吸附氨盐（寡核苷酸），氨盐可以被有机溶液洗脱，但不会被水洗脱，能有效的去除盐分，纯度可满足大多分子生物学实验需求。该方法速度快，价格低，但不能有效去除比目的片段略短的引物小片段，适合低要求的PCR反应。
• HAP
    HAP纯化柱中装有对 DMT 具有亲和力的树脂，合成DNA 片段时保留 5'端最后一个碱基上的 DMT，所有合成产物吸附在柱上以后，用稀的有机溶剂洗柱，带有 DMT 的片段吸附能力强，不易被洗脱，不带有 DMT 的片段吸附能力弱，被洗脱。然后用三氟乙酸 TFA 或三氯乙酸 TCA 脱去 DMT 基团，再用浓一点的有机溶剂洗脱 DNA。这种方法具有多快好省的特点。制品纯度可达到80~90%，可以满足杂交探针、测序、常规PCR（不再做进一步克隆实验）等用途了。但是因为其专一性吸附 DMT 能力有限，不免仍然有短片段带入的可能，而且负载量小。特别是对长于39 碱基以上的片段纯化效果不好，若考虑节约经费，对于要求较低的实验，采用HAP纯化即可。
• RPC
    RPC纯化是通过反相净化滤芯 (Reverse Phase Cartridge) 对引物进行纯化，纯化原理与反相HPLC纯化一样。与反相HPLC比较，RPC是一种有效且更加经济的纯化方式。反相净化滤芯通常包含一种疏水基质如 C18的硅胶，能够很好的吸附DNA，并且可以用水轻松地将切割下来的保护基团和短的引物片段从反相柱上洗掉。RPC纯化的引物可以应用于DNA测序、 PCR及基因合成等。
• PAGE纯化
    该方法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化基于尺寸和构象分离全长产物和失败序列，可以分离相差一个碱基的引物(120碱基以内)，从而提供高纯度的引物。纯化后的DNA纯度大于90%，相比与其他两种方法，PAGE纯化对长链Oligo DNA (大于50 mer)的纯化特别有效，制品纯度可达90 ~ 95%。可用作RT-PCR引物、各种探针，或用于PCR克隆测序、定点突变等。
• HPLC纯化
    HPLC是使用高效液相色谱的原理，依据DNA的疏水性来分离产物的。合成粗产物中不同长度的 DNA 片段的疏水性不同，一般来说较长的片段具有较强的疏水性，AT含量高的片段也具有较强的疏水性。先将粗产物检测主峰位置，再增加加样量，回收主峰位置的部分。该方法用于分离纯化时能达到很高的纯度和灵敏度，可以有效的去除大部分短片段，从而对DNA片段进行纯化。由于HPLC产品的纯度非常高，使用本法纯化的DNA制品可适用于各种分子实验，当然这种方法的成本也是最高的。

应对办法

1. 引物设计
     引物合成过程中，造成碱基缺失，插入，置换突变的因素客观存在，合成的片段越长副产物越多，尤其是短片段，虽然可以通过纯化不同程度地得到去除，但很多合成公司为了节省成本选择的纯化方式你是不清楚的，为了尽可能降低短片段的比例，设计引物时，在保证特异性的前提下，可以减少引物的长度。如果你发现PCR产物特异性总是很差，这是你就要更换合成公司或者选择纯度更高的纯化方式了。
2. 选择合适的纯化方式
     DSL只是简单的脱盐处理，不能去除短片段，一些价格极低的合成公司就是这种纯化方式，一般第二天就能到货，选择需要慎重。HAP、RPC只能去除部分短片段，效果比DSL好一些，但高要求的PCR、高保真克隆、全基因合成推荐选择更好的纯化方式。对40 mer以下的DNA制品，HPLC是最好的纯化方法，其次是PAGE；而对40 mer以上的DNA制品PAGE纯化要优于HPLC纯化。

纯化方法	描述	优势
脱盐 （25 nm: 10–100 bp; 50 nm: 5-100 bp )	采用正相色谱柱处理寡核苷酸，去除盐但不去除失败序列。	即用型无盐 DNA 溶液；适用于许多 PCR 和测序分析，无需进一步纯化。"
过柱 （50 nm–1 µm, 7-55 bp)	基于反相色谱；从完成的合成中去除失败序列。	提供某些分析应用所需的全长序列
HPLC (50 nm+, 10-55 bp)	反相高效液相色谱（HPLC）以与过柱纯化相同的方式去除失效序列或未掺入的标记。	保证某些分析应用中需要的高度纯化的引物（> = 85％ 全长）。
PAGE (200 nm+, 7-100 bp)	用于根据大小和构象区分全长产品和失效序列的方法。	提供特定应用（例如诱变或接头生产）所需的最高比例的全长寡核苷酸（> = 85％）。

  引物是PCR成功与否最重要的影响因素之一，影响PCR成功率的因素我们后面还会讨论。一般来说，在引物区发生突变的概率不大，但是偶尔也会发生，合成公司一般都有对应的赔偿措施，但花费的时间精力是你的，因此进行比较重要的实验时，尽量不要在引物合成上节约成本。