2020-02-29 寻找rDNA的足迹（10）——siRNA对核仁显性的调控

1st

• 文献title The critical function of the plastid rRNA methyltransferase, CMAL, in ribosome biogenesis and plant development
• 文献推送链接 https://mp.weixin.qq.com/s/liuiIFEXavsENgPBvdfO_Q
• 文献链接 https://mp.weixin.qq.com/s/liuiIFEXavsENgPBvdfO_Q

研究背景与问题

• 背景
  • rRNA的甲基化修饰是生物界中普遍存在的一种转录后修饰机制。它可以改变rRNA分子的局部空间结构，从而优化核糖体的蛋白翻译效率。
  • 不同物种之间的rRNA甲基化程度存在明显差别，是rRNA进化的标志性事件之一。
  • 叶绿体具有自己的核糖体RNA，有自己的核糖体，因而能够独立地进行蛋白质合成。
• 问题：绿体内是否存在rRNA甲基化现象，催化rRNA甲基化的分子装置以及其可能的生物学功能。

研究过程与实验思路

• 亚硫酸盐测序在叶绿体16S rRNA中鉴定到一个甲基化位点C1352。
• 分离了一个拟南芥突变体cmal，在该突变体中C1352位点不能进行正常的甲基化。
• 基因克隆表明，CMAL基因编码一个定位于叶绿体的SAM依赖型的RNA甲基转移酶。
• 进一步的研究表明，该位点的甲基化修饰如果被破坏，叶绿体核糖体的组装将会受到严重影响，叶绿体mRNA的翻译效率因此也将会大幅下降。
• CMAL的缺失不仅使叶绿体功能受到影响，植物根和叶的发育过程也会受到影响，表现出类似生长素缺失的表型。

表达积累

• sth is a ubiquitous feature that occurs in all living organisms. STH是生物界中普遍存在的
• sth remains to be determined. STH有待研究

2nd

• 文献title Nucleolar dominance and ribosomal RNA gene silencing
• 文献链接 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2912983/

综合的研究结果与来源

• 核仁显性是rRNA基因剂量控制的一种表现，它也发生在非杂种中，根据细胞对核糖体和蛋白质合成的需求来调节活性rRNA基因的数量。
• 在动物中，Pol I转录因子UBF（Upstream Binding Factor）对于NOR的形成很重要，由重复的UBF结合位点组成的“pseudo-NORs”结构的相关研究可以证明这一点。[5，6]
• 植物中目前还未发现明显的UBF同源物，但它们的次级收缩（如动物的收缩）被银强烈染色，植物中非活性NORs在中期处于完全缩合的状态。中期NOR缩合的差异反映了间期rRNA基因的表达活性状态，这是最初发现核仁优势现象的分子基础。[9]
• DNA甲基化的化学抑制剂氮杂脱氧胞嘧啶（aza-dC） 会破坏小麦-黑麦杂种和芸苔属异四倍体杂种的核仁优势。
  曲古抑素A（TSA）抑制组蛋白脱乙酰基，在芸苔属杂种中加入TSA可以抑制核仁显性。
  同时用aza-dC和TSA进行治疗均未产生累加或协同作用，这表明DNA甲基化和组蛋白去乙酰化是同一抑制途径，且为伴侣关系。
  DNA甲基化辅助抑制性组蛋白修饰的发生，组蛋白去乙酰化可辅助胞嘧啶高甲基化 [原文 Blocking DNA methylation was found to prevent the occurrence of repressive histone modifications, and blocking histone deacetylation disrupted cytosine hypermethylation.]，这表明胞嘧啶甲基化和抑制性组蛋白修饰在rRNA基因的self-reinforcing loop中相互指定。
• HDT1和HDA6为核仁显性中rRNA基因沉默所需的[15,16]。
• 拟南芥rRNA基因沉默需要从头甲基转移酶DRM2（de novo methyltransferase），是一种胞嘧啶甲基转移酶。
  敲低十二种预测的甲基胞嘧啶结合结构域蛋白，表明rRNA基因的沉默需要MBD6和MBD10，其中MBD6优先与rRNA基因位点共定位，MBD10定位于整个核。
  免疫定位和染色质免疫沉淀（ChIP）实验表明，MBD6-rRNA基因相互作用依赖DRM2，这表明MBD6可以识别DRM2建立的胞嘧啶甲基化模式。[17]
  在哺乳动物中，甲基胞嘧啶结合域蛋白通过与其他染色质修饰蛋白（包括组蛋白脱乙酰基酶）相互作用来协助异染色质的形成。 作者推测MBD6也可能这样做。[18,19]
• 有证据证明核仁显性现象只是剂量控制的一种表现
  有两种手段抑制核仁显性，通过aza-dC或TSA抑制核仁显性，或者通过敲低所需的染色质修饰活性抑制。
  当核仁显性被抑制后，高表达活性rRNA的转录活性也增加了，这表明剂量控制非显性基因（underdominant genes）沉默的机制也控制着显性rRNA基因。[14]
  染色质免疫沉淀（ChIP）实验表明，组蛋白和DNA修饰控制非杂交拟南芥中 活性rRNA基因 和 非活性rRNA基因 的比例，也控制着杂种的核仁显性。[15]
• 被核仁显性抑制的rRNA基因并非一直没有活性，是以发育调控的方式沉默。 在新发芽的拟南芥种子中，拟南芥衍生的和拟南芥衍生的rRNA基因都高度表达，但随着真叶的出现，拟南芥衍生的rRNA基因逐渐失活。 这些观察结果表明，在每个生命周期的一个或多个关键时刻，都需要两个祖细胞的核糖体RNA基因来满足生物体的生理需求。 在其他发育阶段，核糖体RNA基因可能超出了细胞的需求，多余的被沉默了。
• HDA6和DRM2是核仁显性所必需的，这表明拟南芥中核仁显性RdDM途径（RNA-directed DNA methylation pathway）存在联系，因为这两种活性物质均已在遗传筛选中被确定为RdDM途径的成分。[35,36]
  RdDM途径：RNA聚合酶IV（植物特有）合成转录本 → 该转录本被RNA聚合酶（RDR2）作为模板，合成双链RNA（dsRNA） → Dicer-like 3（DCL3）将dsRNA切成24Nt的小片段 → 小片段的dsRNA（siRNA）被装入含ARGONAUTE 4的效应复合物 → 该复合物将DRM2（一种胞嘧啶甲基转移酶）引导至与siRNA同源的DNA序列 → DRM2发挥功能，将胞嘧啶甲基化。[17]
  以上内容的证据：①RNAi敲低RDR2、DCL3或DRM2，破坏了拟南芥中rRNA基因的沉默； ②在DCL3-RNAi株系，中与rRNA基因启动子和基因间区域相对应的小RNA消失了，同样，在RDR2-RNAi植物中也没有，这表明siRNA在拟南芥rRNA的选择性沉默中发挥了作用。
• 选择沉默哪些基因的分子基础尚不清楚。
• 文中提到，短干扰RNA（siRNA）或结构化调节RNA在植物或哺乳动物的rRNA基因沉默中分别起作用，表明RNA可能赋予选择机制特异性。
• 对比了哺乳动物和植物中RNA介导rRNA沉默系统的异同处，最后说：在植物和哺乳动物中rRNA基因沉默机制在总体上惊人的相似。[11,20]
  • 哺乳动物中，NoRC通过aza-dC和TSA可逆的方式（What? ）抑制rRNA基因的转录，和植物中一样涉及到DNA甲基化和组蛋白脱乙酰化。[39]
  • 哺乳动物中，NoRC可以和Sin3共抑制复合物互作，这种复合物包括组蛋白脱乙酰基酶HDAC1和HDAC2 ，它们与拟南芥中HDA6是同一基因家族的成员。 [44，16]
  • 哺乳动物中，NoRC可以和DNA甲基转移酶DNMT1和DNMT3互作[39,45]，DNMT3是从头DNA甲基转移酶，结构与拟南芥中DRM2相似，在拟南芥中这是核仁显性所必需的。
  • 在哺乳动物和拟南芥中相似的是，活性基因启动子均与H3K4me3以及H3和H4组蛋白超乙酰化相关；rRNA基因的沉默与H3K9的甲基化、H3和H4的脱乙酰化相关，并且被沉默的rRNA具有胞嘧啶高甲基化的启动子。
  • 而且，在两者中，由基因间隔子序列产生的RNA分子都表现出介导沉默的功能。[17,41,42]
  • 不同的是，植物似乎通过siRNA定向诱导胞嘧啶甲基化和异染色质形成使rRNA基因沉默，这是贯穿整个基因组的过程；而哺乳动物似乎已经进化出涉及长的非编码rRNA基因pRNA和NoRC的特异性系统。

观点与展望

• 核仁显性和哺乳动物X染色体随机失活不同，它不是随机的，总是沉默同一个亲本的rRNA基因。这意味着存在基因组中不同rRNA基因选择的机制。
• 这种选择机制不是基于NOR上rRNA基因的数量。有实验证明，具有较少rRNA基因的NOR可以比较多的占优势。[34,49]
• 有的假设说，物种特异的转录因子的失活可能会导致与之匹配的rRNA基因失活，即核仁显性中特定rRNA基因的失活是因为其转录因子具有物种特异性，该转录因子在杂种中的失活导致了核仁显性[50,51]。 但这个假说在植物中是不成立的，将rRNA基因转染到其他物种的实验结果显示，转入的rRNA完全可以发挥功能[52,53]。
• 也有假设道，显性的基因与一种或多种转录因子具有更高的亲和力，更容易被识别、转录。这个假说源于一个在非洲爪蟾卵母细胞中做的实验，研究者将大量rRNA小基因注入爪蟾卵母细胞中############################# 待补充 ######################### [54，55，56]。然而在植物细胞中的瞬时表达和体外转录实验不支持这个假说[52,53]。
• 以这些假设为背景，RNA参与核仁优势的证据着实令人兴奋，因为原则上，RNA的碱基配对相互作原则可以被用来区分不同来源的rRNA基因。
• 文中提供了一种可能性：显性rRNA基因的转录导致了隐性rRNA的沉默。利用生成的可以与同源位点反式作用的siRNA帮助DNA甲基转移酶定向到隐性rRNA基因位点，将其甲基化。
  但尚不清楚的是，为什么siRNA只在反式作用于隐性rRNA基因，而不会沉默它自己的基因座。
  这种假说还有一个不能解释的现象： 在拟南芥杂种中，转入并整合在其他基因座上的隐性rRNA基因并没有被沉默[59]。也就是说核仁显性的调节可能是以NOR为单位进行调节的，而不是单个rRNA基因[58]。
• 作者提到，确定调控RNA的非编码转录本的来源、确定其在发育过程中的调控、确定rRNA基因的特异性以及寻找阻止起调控作用的RNA“滥杀无辜”的因素将是未来几年被关注的问题。

表达积累

• Nucleolar dominance describes the expression of 45S rRNA genes inherited from one progenitor due to the silencing of the other progenitor’s rRNA genes.
  progenitor a person or thing from which a person, animal, or plant is descended or originates; an ancestor or parent.

• Nucleolar dominance is a manifestation of rRNA gene dosage control. 核仁显性是rRNA基因剂量效应的表现

• Despite its ~80 year history and its occurrence in interspecific hybrids [中间杂种] ranging from plants, invertebrates [无脊椎动物], frogs, flies, fish and mammals, the mechanisms responsible for nucleolar dominance are still not resolved.

• The hypothesis that ... ... has been largely supplanted by evidence that ... .... 这个假设... ...完全被... ...证据替代。 即某个证据推翻了或验证了某个假设。

• In agreement with these results, ... .... 与这些结果相一致，... ...。

• NoRC inhibits rRNA gene transcription in an aza-dC and TSA-reversible manner. ... ... 以一种 ... ... 的方式抑制rRNA基因的转录。

• Determining the origins of noncoding transcripts giving rise to intergenic regulatory RNAs, determining their regulation during development, identifying the basis for rRNA gene specificity and what prevents regulatory RNAs from silencing all rRNA genes in the genome are questions that will provide focus in the coming years.

• 词汇

  • allotetraploid hybrid 异源四倍体
  • underdominant genes 到底是显性基因还是非显性基因呢？
  • eliminate 消除
    estimate 估计