空间转录组简介-2022-07-04

空间转录组学简介

原理

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• step1：新鲜冷冻组织切片成像

  • 冷冻组织不能直接用液氮，急速降温会导致细胞损伤，10X建议用OTC包埋的异戊烷速冻组织：
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• step2： 放置在包含与RNA结合的捕获探针的阵列上

• step3：组织固定并透化 释放RNA，与相邻的捕获探针结合 ==> 捕获基因表达信息

• step4：捕获的RNA与空间条形码捕获探针相结合，==> 捕获的mRNA合成cDNA，制备测序文库

• step5：对文库测序并可视化数据

步骤

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• 对经过OTC包埋的新鲜冷冻组织切片，放置到捕获区域上

• （用甲醇）对组织进行固定、H&E染色、拍摄明场图片

• 组织透化

• 反转录&&建库测序：释放的mRNA的ployA尾结合探针的oligo（dT），反转录cDNA ==> cDNA扩增、纯化和质控 ==>片段化、末端修复、加A和连接头 ==> 样本indexPCR，建库测序

• 测序文库：
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  • 备注：
    • 使用双重索引，i5 && i7
    • 对read2的长度有要求

样本质控

实验质控标准

• Rin：RNA完整度 > 7
• 组织样本切片完整且不褶皱

关于组织优化（tissue optimization）

• 目的：寻找一个最佳条件（可能是透化时间），使得组织样本中mRNA能被最大化充分释放
• 判断是否优的方法
  • 组织染色==> 透化 ==> cDNA合成时，再dNTP上有SN3荧光基团，通过荧光显微镜判断哪个实验条件下的组织切片释放的mRNA量最多
• 组织透化
  • 不同组织的细胞组成及空间构成存在明显异质性，在进行正式空间转录组建库实验前，对每种组织类型进行透化实验，摸索最佳的条件。选择荧光强度最亮的作为正式实验的透化条件

10X透化与建库

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slide结构

• 4个Capture Area（6.5*6.5mm，每个区域含有5000个被条形码标记的点（barcoded spots））
• 每个Capture Area尺寸为6.5mm x 6.5mm
• Capture Area中总共有约5000个capture mRNA的点
• 每个capture mRNA的点上有百万个oligo
• 每个capture mRNA的点，点的直径为55μm，点与点之间的中心距离为100μm

每个oligo结构

• read1
• Sptial barcode：用于回溯空间位置信息
• UMI：用于无偏计数分析
• oligo（dT）：用于捕获真核生物RNA的ployA尾巴

关于数据分析

• 所处步骤：切片==> 透化 ==> 建库测序 ==> 数据分析

10X与BGI

• 10X：
  点的直径为55μm，点与点之间的中心距离为100μm

参考

• 10X官网：
  https://www.10xgenomics.com/spatial-transcriptomics/
• 有文献解读的：
  空间转录组介绍 - (jianshu.com)