文献学习020--[sc]单细胞核测序揭示扩心病儿童细胞特征调节的新机制

1. Age-Dependent Changes in Cellular Composition in Pediatric DCM

作者对6例因终末期扩心病进行心脏移植的患儿（0.5, 0.75, 5, 6, 12和13岁）的左室组织进行了单细胞核测序（没有正常对照哦）。患者信息如下表：

Fig 1A：一共得到18211个细胞核，分为14个cluster。注释得到6个主要细胞群，包括心肌细胞（3群），成纤维细胞（1群），内皮细胞（3群），白细胞（1群），周皮细胞（1群），平滑肌细胞（1群）和炎症细胞（1群）。
Fig 1B C：特征性marker基因的表达。基本都比较常规。其中有两群被注释为low.Q的细胞（每个核有很高的基因数，有可能是双核或多核）还有一群细胞，通过了质控但是同时表达FB核EC的基因，就被注释为EC-FB。还有一群表达神经元marker（比如neurexins, NCAM）但是不表达经典的浦肯野细胞或其他神经细胞特异性基因，因此被注释为neuronal-like cells。

心肌细胞：TNNT2
内皮细胞：CDH5
成纤维细胞：PDGFRA
周皮细胞：PDGFRB
平滑肌细胞：MYH11
免疫细胞：PTPRC (CD45)

Fig 1D：不同病人的细胞umap图和细胞比例。结果显示，患者年龄越大，成纤维比例越高，心肌细胞比例越低。而且随着年龄增加，白细胞和内皮细胞也有增加的趋势，但是没有统计学意义。

2. Age-Dependent Regulation of Fibroblasts in Pediatric DCM

前面的结果提示，随着DCM患者年龄增加，成纤维细胞逐渐增多。所以作者对这个结果做了验证。
Fig 2A：成纤维的markerPDGFRA的免疫荧光染色和前面的结论一致
Fig 2B C：在更大的DCM队列 (62个病人) 中使用MRI监测了心脏纤维化情况，提示存在年龄依赖的延迟增强。而且这种现象与左室射血分数不相关。

Fig 2

为了更近一步探究成纤维细胞的分子特征，作者对所有的成纤维细胞做了拟时续分析。使用的是monocle2。

Fig 3A：monocle将成纤维细胞分为7个states。
Fig 3B：State1的成纤维主要在<6岁的患者中存在。State6的成纤维主要在12-13岁患者中存在。
Fig 3C：State1和State6的拟时差异基因
Fig 3D：State1和State6的拟时基因的富集结果。State1主要富集到RNA splicing之类的通路，State6富集到很多胶原形成通路。
Fig 3E：查看了State1和State6的一些纤维形成胶原以及各种其他胶原如糖蛋白，蛋白多糖和金属蛋白酶的表达，发现在两组间存在一定差异。

Fig 3

随后作者将成纤维细胞按照患者的年龄分为三组 (<1y, 5-6y和12-13y)。

Fig 4A-D：三组的差异基因（这里只放了两个）。<1y的成纤维高表达EGR1，这个基因可以诱导胶原表达但是也可以诱导心脏成纤维细胞凋亡，同时这组细胞还表达LIF (leukemia inhibitory factor)的受体COL6A6，这个基因可以降低纤维含量和基质蛋白酶活性，还有SULF1，可以促进血管内皮生长因子的生物活性。12-13y的成纤维细胞高表达的基因包括CYP1B1，这个基因是内源性代谢通路的调节分子，参与angiotensin II介导的纤维化。一些成纤维细胞活化marker如periostin (POSTN)和fibronectin (FN1)也出现升高。
Fig 4E：免疫荧光验证COL6A6的蛋白表达，和上面的结果一致。

因为这些基因表达模式可能潜在的受到基础心脏疾病及心脏移植的影响，作者比较了未受损的出生后小鼠和成年鼠的成纤维细胞基因表达（用的是已经发表的RNAseq数据）

Fig 4F G：RNAseq的一些基因表达变化情况与单细胞的结果一致（这里如果是没有变化的才可以说明DCM时间越久/患儿年龄越大，成纤维细胞的促纤维化功能越强吧。这个结果只能说成纤维细胞的促纤维化功能与年龄有关，不过这也可以理解，possibly reflecting the need for additional stability or disease- related processes in hearts beyond infancy. ）

Fig 4

小结：这些数据提示心脏成纤维细胞的数量和转录模式在儿童和青少年中存在差异。

之前看过一篇nature，做的白癜风的发病机制，白癜风在人体的分布也是因为身体不同部位的成纤维细胞存在异质性¹。

3. Age-Dependent Change in Cardiomyocyte Signatures

前面的结果提示随着年龄增长，心肌细胞（核）的比例逐渐下降（Fig 1D）。前面看了成纤维的异质性，这部分也看一看心肌细胞的异质性。

Fig 5A：甜甜圈图展示了三组sample的各类细胞的uniquely upregulated genes。group <1 of age的差异基因中，心肌细胞的差异基因最多。在另外两组中，心肌细胞的差异基因占比没有这么大。

这样展示差异基因也挺好玩的，让我想起单细胞测序揭示心衰患者循环免疫细胞的广泛变化这篇文章的Fig 1I，用韦恩图看哪类细胞群贡献了更多的差异基因。

Fig 5B：和Fig3一样，给几个心肌细胞群做了monocle2，分为5个state。
Fig 5C：State 3的心肌主要在<1岁的患者中存在。State 1和State 5的心肌主要在12-13岁患者中存在。
Fig 5D：State3和State1的拟时差异基因
Fig 5E：State1，State 5和State3的拟时基因的富集结果。State 1和State 5主要富集到血管生成，内皮细胞分化，细胞外基质形成以及肌肉收缩，局部粘附和细胞死亡相关的通路，State3的基因富集到肌肉收缩和发育的通路。

Fig 5

Fig 6A B：前面说State 3的心肌主要在<1岁的患者中存在，A的热图显示了心肌细胞State 3的top高表达基因。 其中包括cyclin D (CCND2)和ERBB2这两个细胞周期调节基因，提示<1y的心肌仍然存在高度分化潜能。
Fig 6C：免疫荧光验证了CCND2的表达
Fig 6 D：和成纤维一样，在幼年和成年小鼠心肌细胞中检测了这两个基因的表达，也出现了下降。
Fig 6 E F：State 3 (<1岁) 的心肌细胞中还存在代谢基因表达谱。表现为高表达糖酵解基因和相对低表达脂肪酸代谢基因。
Fig 6 G：其他State 3 (<1岁) 的心肌富集到的基因包括细胞周期调节基因BTG。
Fig 6 H：免疫荧光验证BTG的下调
Fig 6 I：在幼年和成年小鼠心肌细胞中验证BTG的表达下降。
Fig 6 J：此外作者还观测到不同年龄患者的心肌细胞存在肌球蛋白亚型从MYH6向MYH7的转变。（这个发现也不surprising啊，之前就报道过的。见下图）

Circulation Research. 2020;126:1086–1106

Fig 6

4. Changes in Cardiomyocyte β-Adrenergic Signaling Transcriptomes

因为β-AR信号通路在成年HF患者中是异常的，而且有研究报道儿童DCM和成人相比β-ARs表达更低。

Figure VIa：作者在心肌细胞的5个state中查看了ADRB1和ADRB2（β1- and β2-ARs）随着拟时间轴的变化。结果提示两个基因都有下降趋势，但是ADRB1:ADRB2的比例没有变化 (4.11 in
infants; 4.44 in children 12–13 years of age)
Figure VIb：但是作者关注到了显著的下游信号通路的表达变化，表现为和infant心脏相比，older的DCM患者β-adrenergic Gs信号通路的下调和maladaptive β2 Gi下游信号通路的上调。

Figure VI

参考文献：

1. Anatomically distinct fibroblast subsets determine skin autoimmune patterns