第二代测序—illumina测序原理

陈巍学基因-illumina测序原理
官方-illumina测序原理
步骤：
一、sample prep（样本准备）：基因文库制备（一个基因组切断再加接头）
二、cluster generaton（簇的形成）：文库在测序芯片（流动池flowcell）上不断扩增，形成桥式PCR，再切掉反向链（reverse strand），形成许多簇相同的正向序列（正向链forward strand）。

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三、sequencing（测序）：荧光信号、可逆阻断终止技术、Sequences-by-Synthesis
四、data analysis（数据分析）

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具体内容：

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一、基因文库：

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• 接头不仅含有与测序芯片上互补的序列，有时还有index序列，由于测序芯片的强大，一个芯片可以同时测许多样本（动物、植物、微生物），那如何区分测序数据来自哪个样本呢？加标签即加index序列，从而来区分不同的样本。

二、桥式PCR：文库种到测序芯片，并进行扩增的过程。
测序芯片：

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• 形成簇之后，加入带不同荧光标记的dNTP（含有叠氮基团）和聚合酶，使得带荧光标记的dNTP结合到测序链上，再进行激光扫描，得到荧光，推出结果。碱基结合到测序链并发出荧光信号的过程被称为Sequences-by-Synthesis。
  
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• 由于叠氮基团的存在（可逆阻断终止技术），一个循环只能延长一个碱基，即一个碱基结合到测序链上为一个循环，当结合上一个碱基后，把其他dNTP和酶用水冲掉，然后进行激光扫描，根据激光扫描颜色判断是哪个碱基，根据互补原则反推出结果，再切掉叠氮基团，进入新的循环，加入新的dNTP和酶，再延长碱基，冲掉dNTP和酶，再激光扫描。
• 读取index（Barcode）: 和读取测序链一样的原理，读取的目的是为了确定样本的来源。

三、双末端测序：即对正向链测序也对反向链测序。

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