15-IF12+:纯生信探索甲基化水平的缺失和免疫治疗反应的关系

一.研究背景

肿瘤突变负荷（TMB）和拷贝数是预测病人免疫治疗发应的预测标志物，之前的研究表明，有丝分裂和TMB、拷贝数以及发生在PMD区域的低甲基化水平相关，之前已经有很多研究探索了免疫治疗反应和TMB以及拷贝数特征的关系，但很少有研究去探究甲基化水平的缺失和免疫治疗反应的关系。

其中，部分甲基化结构域（PMD）是基因组的一个延伸区域，在该区域表现出了降低的平均DNA甲基化水平，PMD主要集中在那些编码基因很少或者是转录失活的区域。LINE是长散在重复序列(long interspersed nuclear elements，LINE)，意为散在分布的长细胞核因子，是散在分布在哺乳动物基因中的一类重复序列，这种重复序列较长。

今天小编就和大家分享一篇关于探索病人整体甲基化水平的缺失在免疫治疗方面影响的文章【Genetic alterations of m6A requlators predict poorer survival in acute myeloid leukemia.】。 杂志：Journal of Hematology & Oncology   IF：8.731   发表日期：2017.2.2

本文通过LINE-1探针中甲基化表达的平均值用来衡量一个病人的整体去甲基化表达水平。

在本篇研究中，Hyunchul Jung等人将关注的点集中到DNA甲基化水平缺失上，想去探索病人整体甲基化水平的缺失在免疫治疗方面的影响。通过整合TCGA11种癌症数据进行实验分析，他们发现免疫调控通路相关的基因主要富集到的是PMD区域上，并且免疫调控通路相关的基因在那些CpG岛启动子超甲基化发生的去甲基化肿瘤中转录是被抑制的。进一步结合接受免疫治疗的样本数据，Hyunchul Jung等人还发现那些整体甲基化水平比较低的患者更容易从免疫治疗中受益。

二.方法和材料

（1）数据：从PanCancer Atlas（https://gdc.cancer.gov/aboutdata/publications/pancanatlas）中获取TCGA数据库中11种癌症的癌症的甲基化、mRNA表达和临床数据；

（2）PMD甲基化水平数据：从Zhou等人[1]的研究中获取（https://zwdzwd.github.io/pmd）。

（3）多倍体数据和肿瘤纯度数据：从Taylor等人[2]的研究中收集得到多倍体数据和肿瘤纯度数据。

（4）体细胞突变数据：从Davoli等人[3]的研究中获取体细胞突变数据。

（5）整体甲基化水平：对于每一个样本，得到LINE-1所有探针（具体参照GPL16304注释信息）的表达β值，进一步计算这些探针甲基化表达值的平均值，该平均后的值就作为样本的整体甲基化水平。

（6）高低甲基化组：基于整体甲基化水平的30%分位数和70分位数，将样本划分为低甲基化水平组（<30%分位数）和高甲基化水平组（>70%分位数）。

（7）细胞系数据：收集来自ENCODE数据库中5个正常（HUVEC、IMR90、NHEK、BJ_1和BJ_2）以及来自UCSC和ENCODE的10个癌症细胞系（MCF-7、SK-N-SH、HepG2、HeLa、A549、G401、LNCaP、T47D、H460和Caki-2）。

（8）功能富集分析：使用GSEA软件对早期复制和后期复制的基因的功能进行富集分析。

（9）接受免疫治疗的数据：整理来自SMC以及IDIBELL中抗PD-L1的肺癌数据和TCGA中接受了免疫治疗的黑色素瘤数据。

（10）PMD亚型的识别：基于样本的甲基化值和复制的时间点进行层次聚类，根据三类间不同长度的PMD分布，最终识别出了长PMD（L-PMD）、短PMD（S-PMD）以及中等程度的PMD（I-PMD）三类。

（11）生存分析：采用log-rank检验衡量两组之间生存曲线的差异。

三.结果展示

1.  整体甲基化水平相关性分析：在TCGA泛癌分析中，如上述方法中描述的那样得到整体甲基化水平，Hyunchul Jung等人进一步去刻画整体甲基化水平和扩增（Fig 1a）、TMB（Fig 1b）、非整倍体（Fig 1c）以及CD8 T细胞表达水平（Fig 1d）之间的关系。

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Fig 1. 整体甲基化水平的相关性分析

2.  刻画整体甲基化水平与免疫的关系：从Fig 1d中，发现整体甲基化水平与CD8 T细胞表达相关，进一步整合免疫相关通路，通过GSEA工具，是识别和整体甲基化水平、TMB以及非整倍性相关的通路（Fig 2），得到了与整体甲基化水平相关的免疫调控相关通路，如ANTIGEN_PROCESSING_AND_PRESENTATION、major histocompatibility complex (MHC)、cytokine–cytokine receptor interaction、interferon or other cytokine signaling和complement and coagulation等。

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Fig 2. 整体甲基化水平的相关性的免疫相关通路富集分析结果

3.  识别后复制基因的机制：因为甲基化水平的缺失主要发生在后复制区域，进一步探索这些后复制基因的转录抑制是否是由于整体甲基化水平的缺失所引起的。基于细胞系数据，通过比较正常和疾病细胞中的基因表达模式，识别早期复制基因和晚期复制基因，比较两组基因之间基因表达、发生高甲基化cpg位点数、富集到的细胞周期相关通路数、富集到的免疫相关通路数以及相应的GSEA得分分布情况（Fig 3）。

Fig 3. 后复制基因参与功能的全面刻画

4.  PMD中免疫基因的抑制：位于PMD中的基因的表达是受到抑制的，基于甲基化值和复制的时间点进行层次聚类，识别出了长PMD（L-PMD）、短PMD（S-PMD）以及中等程度的PMD（I-PMD）三类，进一步比较L-PMD、S-PMD以及I-PMD三类之间片段的长短，之前有研究报道，较短长度的PMD更能反应PMD特性，接下来，对S-PMD从富集到的功能，基因表达水平以及超甲基化cpg位点的分布情况进一步刻画（Fig 4）。

Fig 4.PMD区域的进一步分类刻画

5.  甲基化预测免疫反应：收集来自SMC以及IDIBELL中抗PD-L1的肺癌数据和TCGA中接受了免疫治疗的黑色素瘤数据（Fig 5a），与依照TMB信息划分样本生存的情况比较，在Fig 5a中的数据集中去检验高低甲基化组病人之间的生存情况，发现基于甲基化水平的高低确实对于使用过免疫治疗药物的病人的生存有很好的预测（Fig 5），发现高甲基化水平组病人本身生存更好，对于那些低整体甲基化水平的病人来讲，使用相应的免疫治疗药物对其生存会有很大的改善。

Fig 5. 甲基化水平预测样本的免疫反应

6.  解析非整倍性：结合体细胞突变数据，Hyunchul Jung等人进一步去看整体甲基化水平高低能否解析与非整倍性之间的关系，发现整体的高低甲基化水平组体细胞突变（Fig 6）。

Fig 6. 整体甲基化水平与非整倍性的关系

四.结论

（1）甲基化水平的高低某种程度上反应了宿主对免疫治疗是否有反应的一个更为有效的预测；

（2）对于那些存在整体甲基化水平缺失的病人来讲，使用免疫治疗药物对于这一类病人的生存时间会有显著地改善；

五.参考文献

1.    Zhou, W. et al. DNA methylation loss in late-replicating domains is linked to mitotic cell division. Nat. Genet. 50, 591–602 (2018).

2.    Taylor, A. M. et al. Genomic and functional approaches to understanding cancer aneuploidy. Cancer Cell 33, 676–689 (2018). e3.

3.    Davoli, T., Uno, H., Wooten, E. C. & Elledge, S. J. Tumor aneuploidy correlates with markers of immune evasion and with reduced response to immunotherapy. Science 355, 8399 (2017).

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