OMG！扩增子大小对qPCR产量影响辣么大～

一般情况下，实时荧光定量PCR引物设计原则中会提到扩增子大小对实时荧光定量PCR的扩增效率有一定作用。所以通常建议使用相对较短的扩增子长度，范围为50到150个碱基对（bp）。由于小片段不太容易在传统PCR中所用的琼脂糖凝胶上显现，因此这种小片段扩增在传统PCR中检测更为困难。qPCR的出现使得扩增小于100bp的基因片段成为可能。本文将为大家介绍扩增子大小对qPCR产量的影响，表明使用小片段检测的优势所在。

将大豆的RR和Lectin基因作为研究对象，各基因的正向引物被保留，反向引物以+/-40bp的步进移动以增加扩增子的大小。将正向引物保持在探针附近，以使探针在延伸步骤中被Taq聚合酶的核酸外切酶活性快速水解。RR扩增子大小分别为83、121、160、198、248、319和362bp。Lectin扩增子大小分别为：81、109、158、197、228、288、342和363 bp（图1）。

▲图1：所用引物和探针的位置

采用TaqMan探针法和SYBR Green染料法对不同的样本进行qPCR检测，结果表明扩增子的大小可直接影响检测结果：随着扩增子长度的增加，Cq值整体呈现增加的趋势（表1和表2）。在SYBR Green检测结果中，扩增子长度的增加对Cq值的影响不太明显，但在TaqMan检测结果中，可以发现83bp和362bp扩增子对应的Cq值可最大相差15.63。

▲表1：使用TaqMan法对不同长度扩增子的qPCR检测

▲表2：使用探针法和染料法对不同长度扩增子的qPCR检测

如图2所示，是使用不同的引物获得的扩增曲线线性图谱，对于较短的扩增子，可以被更早地检测到荧光信号（较低的Cq值）以及具有更高的荧光强度（较高的平台期）。对于较长的扩增子，其扩增效率一定程度上降低。83bp和121bp扩增子的扩增效率约为100%，随着扩增子长度的增加，扩增效率呈下降趋势，362bp扩增子的扩增效率最低可以达到50%。

▲图2：不同长度扩增子的扩增曲线注：横坐标为循环数，纵坐标为荧光强度

综上所述，发现扩增曲线的动力学效应随扩增子大小的变化而变化，扩增子越小，平台期的荧光强度越高。尤其是在TaqMan检测中，更要注意扩增子大小的设计，为了获得较高的扩增效率以及较低的Cq值，其扩增子长度应控制在50-150bp之间。

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参考文献：

The influence of amplicon length on real-time PCR results. 2017.