测序原理笔记 RNA-seq 和WES--day 5

1，RNA-seq 测试原理
测序步骤，先去除保守的rRNA ，→polyA 尾的特性，用磁珠吸附→Mg镁离子溶液打断mRNA→随机引物变成双链合成第一条cDNA（由RNA变成单链DNA）→再合成第二条DNA（双链DNA）→用相应的酶切加上A，加上Y 行接头（adaptor）
主要应用：差异表达mRNA，可变剪切，融合基因，SNP，

建库

RNA 降解评价，RNA的RIN（RNA integrity number ）> 8 分，比较好；

RNA完整度评估

2，WES 测序步骤
总体的思路是用 外显子探针捕获库 去杂交外显子，然后进行pcr扩增，然后进行测序；
steps： 基因组被打断成片段建成 DNA文库→用结合了 生物素探针的捕获试剂盒进行捕获→用链霉素生物素结合磁珠捕获生物素 →洗脱磁珠上的序列→PCR扩增→测序
主要的应用：发现SNP ，插入缺失突变也就是Indel 信息；不适用：基因结构变异（structure variation，SV），对拷贝数变异（copy number variation （CNV））不敏感，如果是大片段的拷贝数变异，比如5M 以上，因为大片段会出现多个外显子，（全基因组测序，发现SV 和CNV），不能发现基因表达的差异；

step1：

step2：

step3：

step4：

3，名词解释

• 测序深度：就是把整个外显子测了多少遍的意思；
• 测序中出现的无效数据的来源1：和外显子有相似性的序列，同源序列；2，捕获的序列凸出于外显子之外；3，去duplication，因为pcr扩增出的 同一个序列，被测序很多次，需要去掉这些重复；4，文库构建时的长度 小于测序的长度，出现冗余

• 高质量数据的特征：覆盖深度均匀

  
  
  覆盖深度均匀

• 无效数据来源，图示
  3.1同源序列

  
  
  同源序列
  
  

  3.2 突出外显子之外；

  
  
  凸出外显子之外
  
  3.3 所测序的数据占总外显子的比例（捕获效率，capture efficiency），60~70%
  3.4
  冗余序列

biotin ，生物素；streptavidin 链霉亲和素

比较：WES，RNA-seq，这几个测序的差异
单端测序 和双端测序

单端和双端测序