文章信息
题目：Metabolic regulation by PD-1 signaling promotes long-lived quiescent CD8 T cell memory in mice
期刊：Science Translational Medicine
日期：13 October, 2021
链接：https://www.science.org/doi/10.1126/scitranslmed.aba6006
摘要
在慢性病毒感染和癌症中，功能失调的CD8 T 细胞可以通过程序性细胞死亡受体1 (PD‑1) 轴发挥抑制性作用。尽管PD‑1在急性感染和免疫接种过程中也会被短暂地诱导至较高水平，但其对长寿命抗原非依赖性记忆T细胞发育的影响仍不清楚。除了其抑制克隆效应扩增的预期作用外，在本研究中，我们证明了PD‑1在抗原特异性CD8 T细胞上的表达对于抗原清除后形成持久的记忆CD8 T细胞库是必需的。T细胞特异性PD‑1信号的丢失导致记忆CD8 T细胞响应稳态细胞因子信号收缩的增加和抗原非依赖性更新缺陷，从而导致记忆CD8 T细胞库随着时间的推移而损耗。尽管在慢性病毒感染期间，耗竭的CD8 T 细胞在PD‑1检查点阻断后重新恢复功能，但响应先前经受免疫原产生应答的静息态功能性旁观者记忆CD8 T细胞库则减少了。在代谢方面，PD‑1信号轴对于调节mTOR依赖的合成代谢糖酵解和脂肪酸氧化程序的平衡是必要的，以满足静息态记忆CD8 T 细胞的生物能量需求。这些结果表明，PD‑1是保护性T细胞免疫应答的关键代谢调节剂。此外，这些结果对PD‑1检查点阻断治疗期间预先存在的记忆CD8 T 细胞具有潜在的临床意义。
背景
程序性细胞死亡受体1 (Programmed cell death 1, PD-1) 是慢性病毒感染和癌症中T细胞耗竭过程中的中枢抑制性受体之一(1 4)。在慢性抗原暴露期间，如在HIV或丙型肝炎病毒感染和癌症的情况下，T细胞接受T细胞受体 (TCR) 信号刺激诱导活化后(5, 6)，PD-1在耗竭的抗原特异性CD8 T细胞中会持续性高表达，通过减弱TCR和共刺激信号的级联反应来抑制T细胞功能(2)。PD-1表达在慢性抗原暴露期间的功能相关性，可以从PD-1抗体阻断后细胞毒性T淋巴细胞 (CTL) 功能的有效恢复以及病毒载量或肿瘤负荷的显著减弱中体现出(7 13)。目前，PD-1免疫检查点阻断疗法已在几种难治性实体瘤的控制方面取得临床成功，例如肾细胞癌、非小细胞肺癌和黑色素瘤(14 21)。这些发现促进了人们对PD-1介导的耗竭CD8 T细胞功能恢复的细胞(22, 23)和分子机制(24 30)的理解。尽管如此，我们对PD-1信号如何调节功能性CD8 T细胞免疫记忆的形成和维持的理解仍然不完整。这些作用在PD-1检查点阻断免疫疗法中具有临床意义，并且该免疫疗法现已获得美国食品和药物管理局批准用于多种实体瘤的治疗(31)。
记忆CD8 T细胞具有不依赖于抗原的稳态维持、多功能性和对二次免疫应答强烈反应的典型特性，通常在抗原被及时控制的急性感染和免疫接种环境中产生。尽管抗原刺激后的休息对于逐步获得静息态记忆特性至关重要，但CD8 T细胞的记忆命运是在T细胞活化和效应分化的早期阶段决定的，并且由多种因素编程，包括细胞因子、共刺激和共抑制信号以及与其他免疫细胞的相互作用(32 38)。类似于慢性感染(12)，在急性感染的启动和激活过程中，TCR信号会上调CD8+ T细胞中PD-1的表达(39)。在体外，通过TCR刺激人类T细胞也会导致PD-1表达的上调(40, 41)。这种看似矛盾的T细胞活化过程中抑制性受体表达的上调，可以有助于抑制慢性(43)和急性感染中过度的效应反应和相关的免疫病理学(42) [如淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMVArm) (39)、狂犬病和呼吸道合胞病毒(44 46)]。通过Pdcd1、Pdl1/l2胚系基因的敲除或全系统性PD-1/PD-L1抗体阻断策略去除PD-1的抑制作用已被证明在某些情况下会增强效应T细胞反应，例如LCMV和狂犬病(12, 39, 44, 48)，但其他情况则不然，例如单核细胞增生李斯特菌(LM)（49, 51）。有限的研究表明，在PD-1抑制作用丧失后，CD8 T细胞的记忆功能会受到干扰，相反的是，在早期时间点上发现记忆命运细胞增加(39, 52)或呼吸道感染中的记忆细胞减少(48)。因此，需要进一步的研究来确定T细胞在激活过程中，PD-1的早期表达是否与CD8 T细胞效应和记忆命运分化有关，PD-1是否以CD8 T细胞特异性方式发挥作用，或其通过对其他免疫细胞的影响而发挥作用(32,33, 36, 53–55)，以及PD-1如何调节记忆T细胞的发育和维持。
在本研究中，为了阐明PD-1在促进长寿稳态记忆CD8 T细胞池中的内在作用，我们以PD-1通路为中心进行了细胞表型、功能、代谢组学和转录组学的交叉研究。我们在过继共转移环境中进行了研究，其中野生型 (WT) 和PD-1敲除 (KO) 的抗原特异性T细胞的所有环境因素都是相同的，从而绕过了混杂变量如克隆竞争、病毒载量改变或通过抑制PD-1信号传导对其他免疫细胞的间接影响。这些研究将对免疫接种产生影响，其中人们可以通过控制PD-1的表达来促进记忆CD8 T细胞的形成，甚至在临床相关的PD-1检查点阻断治疗中，旁观者记忆CD8 T细胞可能也会受到一定的影响。
结果
1. CD8 T 细胞在启动期间的早期激活、增殖和效应分化在很大程度上不依赖于PD-1信号
PD-1在抗原特异性CD8 T细胞的TCR刺激后早期上调，并在慢性感染期间持续性保持较高表达水平，但在急性感染期间的CD8 T 细胞反应的效应峰值时显著下调(7, 56)。PD-1抑制作用的丧失与大多数病毒感染中效应CD8 T细胞扩增高峰时效应反应和组织病理学损伤的增加有关(12, 39, 43 48)。然而，在急性感染CD8 T 细胞活化期间，PD-1表达的瞬时诱导是否与效应分化的早期抑制有关仍有待确定。为了解决这个问题，我们首先证实了在急性和慢性LCMV病毒感染期间，T细胞在启动阶段能够早期诱导PD-1的表达。意料之中，H 2Db:GP33抗原特异的 P14 CD8 T细胞在感染慢性Clone 13菌株（抗原持久、T细胞耗竭和PD-1检查点阻断的经典模型）或急性Armstrong菌株（导致急性感染并在病原体清除后形成持久的保护性免疫）（57）后的2-3天内诱导PD-1的表达达到同样高的丰度（图 1A）。同样地，在李斯特菌（LM）和痘苗病毒 (VACV)感染中普遍观察到早期 PD-1表达的上调（图S1、A 和 B），并且与细胞分裂的次数无关（图S1C）。与其激活的效应状态一致，PD-1hi细胞同时表达高浓度的T细胞激活标志物，如 CD25和CD69（图S1，A、B 和 D），并显示出原型效应分子的表达模式，如颗粒酶B（Gzmb）和干扰素 γ（IFN g）的诱导（图S1、A、B、E 和 F）。同时，PD-1hi细胞还表现出CD62L和CD127表达的下调（图S1、A、B 和 E）。然而，如前所述，随着感染的持续进展，CD8 T细胞中PD-1的表达在急性和慢性感染之间存在差异（58）。PD-1在慢性抗原感染期间持续性保持较高水平（图1A），并与第40天时细胞因子产生受损有关（图S1F)。相比之下，在急性感染中，PD-1 表达的降低与抗原清除和维持强大的细胞因子产生以响应二次抗原有关（图1A 和图 S1F）。值得注意的是，功能强大的静息态记忆CD8 T细胞保持着中间PD-1 的表达丰度（PD-1int），是PD-1lo的初始CD8 T细胞的两倍，如蛋白水平（图 1A）和转录物浓度（图S1G)。这在人类记忆CD8 T 细胞的研究中也有过类似的报道(59, 60)。
接下来，我们想探究在急性LCMV病毒感染期间，CD8 T细胞中PD-1表达的短暂上调是否会改变早期抗原特异性效应反应。为此，我们过继共转移等量的野生型（WT）以及PD-1敲除的H 2Db:GP33抗原特异的P14 CD8+ T细胞进入到初始C57/BL6小鼠中（图 1B）。该方法绕过了通常在PD-1缺陷小鼠中观察到的自然杀伤细胞、树突状细胞、巨噬细胞、常规CD4 T细胞和调节性T细胞的改变和任何自身免疫缺陷，并允许与其WT样本在相同的感染环境中启动、扩增和分化的PD-1缺陷的P14细胞进行面对面比较，包括相似的病毒载量、炎症和其他免疫信号。正如PD-1表达上调时T细胞反应早期阶段的强烈激活和效应状态所表明的那样，我们发现T细胞特异性PD-1敲除后对急性病毒感染后第2至 3天的早期CD8 T细胞的激活、扩增、和效应分化的影响极小。其中，WT和PD-1敲除亚群的细胞增殖水平相似，如羧基荧光素琥珀酰亚胺酯 (CFSE) 稀释程度所示（图 1C），并在所有淋巴（脾脏和腹股沟淋巴结）和非淋巴（肺、肝脏）组织中积累到大致相似的数量（图 1D）；两种CD8 T细胞群都上调了活化标志物CD25和CD69的表达（尽管PD-1敲除的细胞显示出CD25表达的适度降低），并且还表达了以相似水平的典型效应分子，如在细胞分离后直接量化的颗粒酶B，以及在体外对抗原再刺激反应进行量化的IFN γ 和肿瘤坏死因子 α（TNF α） （图1E）。这些数据表明，在感染和激活的早期阶段，当抗原特异性CD8 T细胞强烈诱导PD-1的表达时，靶向敲除PD-1对T细胞的激活、增殖、和效应分化的影响很小。
图1.CD8 T 细胞特异性PD-1缺陷不影响启动期间CD8 T细胞的活化或增殖。
2. PD-1对急性感染期间效应CD8 T细胞的反应峰值发挥适度的调节作用
在所有免疫细胞中去除PD-1介导的抑制作用（如在胚系基因中敲除PD-1或全系统性PD-1/PD-L1抗体阻断）与不同病毒感染(12, 39,44 47)中效应T细胞的过度激活反应有关，但与细菌感染无关(49 51)。最近的一项研究(48)报道了局部呼吸道感染期间PD-1缺失后肺部的效应T细胞应答能力增强。为了研究T细胞特异性PD1在淋巴和非淋巴组织中调节效应反应的作用，我们比较了WT和PD-1敲除的H-2Db:GP33抗原特异的P14 CD8+ T细胞在过继共转移到腹膜感染LCMV的WT小鼠中后的细胞功能和数量，而不是集中在肺部。在慢性LCMV Cl 13感染中CD8 T细胞特异性敲除PD-1导致感染后第8天P14细胞的增殖和积累明显增加（图S2A）（12、47、48），而在急性感染中，抗原特异性 CD8 T细胞的PD-1缺陷会导致细胞扩增到与WT细胞大致相似的数量，而与前体细胞的频率[低（2000个细胞）（图 S2B）或高（100,000 个细胞）（图 2A 和图 S2B）] 和单一或共同转移的方式（图S2B）无关。尽管如此，与先前的研究相一致(39, 48)，在急性LCMV Arm感染期间，我们发现几乎在所有淋巴和非淋巴组织中，PD-1缺陷的CD8 T细胞的数量出现适度的增加（1.5至2倍）（图2A）。
在效应分化方面，我们发现WT和PD-1缺陷的细胞亚群均表现出相似的效应表型特征，如CD62L和Bcl 2表达的下调，和颗粒酶B、T-box转录因子T bet和效应状态特异性的CD43分子表达的增加（图 2B）。并且，WT和PD-1缺陷的效应T细胞也表现出相似的效应细胞因子如IFN γ和TNF α的产生（图2C）。此外，通过CD107a/b表面分子的测量，我们发现它们在对抗原再刺激的应答中脱颗粒水平也表现出相似程度（图 2D）。同样地，以细胞表面标志物CD127和杀伤细胞凝集素样受体G1 (KLRG 1) (34, 35, 37, 61,62)区分的短寿效应细胞 (SLEC：CD127-KLRG1+) 和记忆前体效应细胞(MPEC: CD127+KLRG1-)亚群的相对比例（图 S2C）和绝对数量（图 2E）在WT和PD-1缺陷的供体细胞之间也表现出相似的水平。
重要的是，WT和PD-1缺陷的效应T细胞在它们的全局基因表达模式上惊人地相似（图 2F，图 S2D）。通过基因集富集分析（GSEA），我们发现经典效应和记忆前体基因集富集分析并不能有效地区分出PD-1野生型和缺陷的细胞。同样地，糖酵解和白细胞介素(IL) 2/信号转导和转录激活因子5 (STAT 5)信号基因集，以及与效应分化相关的基因集(32, 34, 63 65)，在WT和PD-1缺陷的效应细胞中也表现出相似的表达模式（图 S2F和 G）。为了进一步检查WT 和PD-1缺陷的效应细胞之间可能具有的生物学相关的任何更细微的差异，我们对行归一化后的数据进行比较。与基于所有基因表达数据进行的全局归一化相反，在行归一化中，我们将给定的基因在样本之间进行行归一化，以突出甚至是微小的1.1倍差异（图S2H）。聚焦于在效应T细胞中表达显著增加的36个基因构建的基因集，（图 S2I），行归一化分析的结果表明，编码经典效应分子（如穿孔素和颗粒酶）的基因和细胞增殖相关基因，如细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）和极光激酶（AURK）；或转录因子如T bet、Blimp 1和与效应分化相关的碱性亮氨酸拉链激活转录因子样转录因子（BATF），在PD-1缺陷的细胞中以大致相似的丰度进行表达（图S2H)。总的来说，这些数据表明，尽管慢性抗原和局灶性肺部感染中PD-1表达的持续性上调会强烈下调CD8 T细胞的应答能力，但在急性感染的启动期间，PD-1表达的短暂上调对原代CD8 T细胞扩增和效应分化几乎没有调节作用。
图2.CD8 T细胞中PD-1信号在急性感染期间基本上不调节效应细胞分化与峰值扩张。
3. CD8 T细胞特异性PD-1信号对调控长期记忆的形成至关重要
接下来，我们把PD-1野生型和PD-1缺陷型的P14细胞按照等量混合过继转移到新的幼稚小鼠内并感染急性LCMV病毒，分析进入到记忆阶段的PD-1野生型和PD-1缺陷型中CD8 T细胞的分化情况，如图 1B 所示。WT和PD-1缺陷的CD8 T细胞的长期随访显示，尽管这两个亚群中的记忆前体细胞数量相似（图 2E），但PD-1缺陷型的效应CD8 T细胞数量在收缩期间和CD8 T细胞记忆维持阶段（P<0.05）显著减少（图 3A 和 B），因此导致淋巴和非淋巴区的最终记忆CD8 T细胞数均降低约100倍（图 3A，图 S3A）。并且，在低(2,000)和高 (50,000)记忆前体细胞数量（图 S3B 和 C）的环境中，我们均观察到PD-1缺陷型记忆CD8 T细胞的数量减少，表明这不是由于细胞内竞争所导致的。同样地，PD-1缺陷的GP33，NP396和GP276表位特异性也显示在收缩期增加（图S3D）。与WT相比，PD-1缺陷的WT H2Db供体细胞收缩增加，表明除了以CD8+ T细胞内在方式调节收缩外，PD-1还可能通过外在效应影响CD8+ T细胞 (图S3D)。在LM和VACV感染期间也观察到类似的PD-1缺陷的CD8 T细胞收缩增加的现象(图S3E)。这些发现与先前评估呼吸道感染的报告(48)相一致，具有不同的Toll样受体(TLR)、NOD样受体(NLR)、抗原、细胞因子和共刺激信号(5，52)。与T细胞收缩增加相一致，PD-1缺陷的效应细胞在第8天表现出细胞凋亡基因集的显著富集(P<0.001，图3C，图S3F)。总之，鉴于IFN-γ应答和TNF-α信号基因集在PD-1缺陷效应细胞中均显著富集(图S3G至J)，这些结果表明，抑制性PD-1信号可能通过抑制活化效应T细胞中IFN-γ和TNF-α信号下游的促凋亡通路，对扩张期的细胞收缩进行重编程(66-68)。
接下来，我们鉴定了PD-1缺陷型和野生型记忆CD8 T细胞的表型特征。在细胞收缩期间，PD-1缺陷的供体细胞死亡增加，在第60天分析的大多数组织中，记忆CD127HiKLRG-1Lo细胞的比例基本相似(图3D)。然而，我们观察到在PD-1缺陷的记忆CD8 T细胞中，淋巴结归巢分子CD62L在感染后第30天的脾脏(P<0.05)和肝脏(P <0.05)，以及第60天的淋巴结(P<0.05)中表达上调受损，且具有统计学差异(图3E)。与WT记忆CD8 T细胞相比，在记忆期（感染后第60天）仍然保留着少数PD-1缺陷的记忆CD8+ T细胞，记忆T细胞的数目减少了>10倍。并且，在所有淋巴和非淋巴区室中的中枢记忆(TCM，CD127HiKLRG-1LoCD62LHi)和效应记忆(TEM，CD127HiKLRG-1HiCD62LLo)表型细胞的数目均类似地减少了10-20倍。因此，这些结果表明在没有T细胞特异性PD-1信号的情况下记忆T细胞总体的数量显著减少。
接下来，我们进一步比较WT和PD-1缺陷的记忆CD8 T细胞的功能特性。与淋巴和非淋巴区室中PD-1缺失的记忆细胞亚群减少结果相似，我们并未观察到记忆功能的偏斜(图3F和G，图S3L至N)。当评估关键功能特性时，PD-1缺陷的记忆CD8 T细胞在功能上表现与其WT相似，例如响应抗原刺激后产生IFN-γ和TNF-α的能力(图3F，图S3L)，以及响应抗原再激发时的回忆扩增(图3G，图S3M和N)。通过CFSE稀释法和BrdU掺入法测定纯化的WT和PD-1缺陷的记忆CD8 T细胞，我们发现在最低限度体外肽抗原再刺激试验(图S3M)，以及使用异源LM-GP33抗原再刺激的生理学相关的体内实验中它们表现出类似的扩增水平(图3G，图S3N)。同时，对抗原再刺激反应的二次扩增水平在PD-1野生型和缺陷型细胞中也是类似的，它们之间具有可比的TCR转导信号，如对同源抗原响应相似的S6磷酸化水平所示(图S3O)。次级应答的纵向体内随访实验结果显示，与初级应答的情况一样，在抗原清除后，PD-1缺陷的效应细胞经历了更显著的收缩，并且对每个细胞的次级记忆细胞库的贡献较小(图3G和图S3N)。总之，这些数据表明，PD-1信号对急性感染诱导的长期记忆CD8 T细胞的形成至关重要。
图3.CD8 T 细胞中PD-1信号缺失与抗原清除后记忆T细胞耗损增加相关。
4. PD-1信号对于长寿命记忆CD8 T细胞的抗原非依赖性稳态维持是必要的
在收缩期和记忆期抗原清除后，PD-1缺陷的CD8 T细胞死亡增加，表明稳态维持的抗原非依赖性机制出现了失调。与持续性感染(耗竭CD8 T细胞的长期维持依赖于慢性抗原刺激)相反(12，69，70)，经典的记忆CD8 T细胞的存活不依赖于同源抗原的刺激，并且主要由依赖常见γ-链细胞因子如IL-7和IL-15反应的存活和缓慢的稳态周转所驱动 (71、72)。因此，我们首先比较了常见γ-链细胞因子受体在WT和PD-1缺陷细胞中的表达水平。结果发现，PD-1野生型和缺陷型的供体细胞在记忆稳态期间表达出相似水平的IL-7Rα、CD132(常见γ链信号链)和CD122(常见β链信号链)(图4A)。与细胞因子受体相似的表达水平相一致，PD-1缺陷的记忆CD8 T细胞通过Janus激酶(JAK)-STAT途径表现出类似的稳态细胞因子信号的细胞内转导，如它们具有相似的STAT5磷酸化水平所显示的(图4B，图S4A)。
尽管具有相似的共同γ链细胞因子受体的表达水平和下游STAT5信号，在体外对IL-7 (P<0.05，图4C)和IL-15 (P<0.01，图4C)刺激的反应中，以及在体内过继转移到无抗原刺激的幼稚小鼠时(脾和肺中P<0.01，淋巴结和肝P<0.05，图4D，图S4B)，PD-1缺陷的记忆CD8 T细胞的稳态增殖能力显著受损。同时，我们还发现纯化的WT记忆CD8 T细胞随着天数的增加稳态增殖的轮次正常进展，而PD-1缺陷的细胞最低限度地稀释了CFSE染料(图4D，图S4B)，并且没有显示出细胞分裂相关的DNA含量的增加(图S4C)。这些记忆稳态功能的缺陷明显独立于调节效应细胞和记忆细胞命运分化的关键转录因子的差异，如T-box转录因子T-bet和Eomes以及B细胞淋巴瘤6 (Bcl-6)(图S4D)。在PD-1缺陷的H-2Db:GP33抗原特异性TCR转基因CD8 T细胞中，胸腺发育缺陷也不明显，如相似的脾脏细胞数(图S4E)，以及相似的关键表型标记物在幼稚WT和PD-1缺陷细胞中的表达水平(图S4F)所示。除了总的WT和PD-1缺陷的供体细胞稳态外(图4D)，当我们分析具有稳态增殖能力的(CD127Hi或CD 62 hi)记忆T细胞亚群中的稳态增殖时，我们注意到PD-1缺陷的细胞无论在CD127Hi或CD 62 hi记忆细胞胞亚群中(图4E)，其稳态增殖的能力在本质上受到了损害，直至感染后约70天(转入幼稚小鼠后约50天)。在不存在PD-1的情况下，稳态增殖缺陷与所有淋巴组织(脾，P < 0.01；淋巴结，P<0.05)和非淋巴(肺，P < 0.01；肝脏，P<0.05)中记忆性CD8 T细胞的显著减少有关(图4F，图S4B)。除细胞数量减少外，PD-1缺陷的TCM细胞还表达较少的抗凋亡分子Bcl-2(图S4G)，尽管包括Fas、Caspase-3或Bim在内的经典细胞死亡标志物没有明显差异(图S4H)。总之，这些研究阐明了PD-1在调节静息态记忆CD8 T细胞的抗原非依赖性稳态维持特性方面的关键作用。
图4.CD8 T 细胞特异性PD-1信号对记忆CD8 T细胞的稳态周转和维持能力具有重要作用。