RNA-seq入门实战（五）：差异分析——DESeq2 edgeR limma的使用与比较

本节概览：
1.DESeq2、 edgeR、limma的使用
2.三类差异分析软件的结果比较——相关性、韦恩图
3.选取差异基因绘制火山图和热图

承接前期文章：RNA-seq入门实战（四）：差异分析前的准备——数据检查

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一、DESeq2、 edgeR、limma的使用

强烈建议查看官方说明书进行这三种差异分析的学习，链接在文章末尾给出。
注意，这三个包都需要输入counts进行分析，不能用tpm、fpkm等归一化后的数据。
正式分析前先进行目录设置、实验组和对照组的指定：

rm(list = ls())  
options(stringsAsFactors = F)

setwd("C:/Users/Lenovo/Desktop/test")
load(file = '1.counts.Rdata')
dir.create("3.DEG")
setwd("3.DEG")

##设定 实验组exp / 对照组ctr
exp="primed"
ctr="naive"

1. DESeq2

DESeq2是目前最常用的差异分析R包。除了可以导入counts外，如果上游使用salmon，DESeq2官方还给出了直接导入tximport生成的txi对象的方法。counts与txi的获取见RNA-seq入门的简单实战（三）：从featureCounts与Salmon输出文件获取counts矩阵

library(DESeq2)
library("BiocParallel") #启用多核计算

##构建dds DESeqDataSet
if(T){
    dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = counts,
                                  colData = gl,
                                  design = ~ group_list)
    }
if(F){  #若上游为salmon
    dds <- DESeqDataSetFromTximport(txi, 
                                    colData = gl,
                                    design = ~ group_list)
    }


dds$group_list <- relevel(dds$group_list, ref = ctr)   #指定 control group

keep <- rowSums(counts(dds)) >= 1.5*ncol(counts)  #Pre-filtering ，过滤低表达基因
dds <- dds[keep,] 
dds <- DESeq(dds,quiet = F) 
res <- results(dds,contrast=c("group_list", exp, ctr))  #指定提取为exp/ctr结果
resOrdered <- res[order(res$padj),]  #order根据padj从小到大排序结果
tempDEG <- as.data.frame(resOrdered)
DEG_DEseq2 <- na.omit(tempDEG)

2. edgeR

使用EdgeR时注意选择合适的分析算法，官方建议bulk RNA-seq选择quasi-likelihood(QL) F-test tests，scRNA-seq 或是没有重复样品的数据选用 likelihood ratio test。

library(edgeR)  #install.packages("statmod")
library(statmod)

#分组矩阵design构建
group <- factor(group_list)
group <- relevel(group,ctr)     #将对照组的因子设置为1
design <- model.matrix(~0+group)
rownames(design) <- colnames(counts)
colnames(design) <- levels(group)

## 表达矩阵DGEList构建与过滤低表达基因
dge <- DGEList(counts=counts, group=group)
keep.exprs <- filterByExpr(dge) #自动筛选过滤低表达基因
dge <- dge[keep.exprs,,keep.lib.sizes=FALSE] 
dge <- calcNormFactors(dge, method = 'TMM') #归一化因子用于 normalizes the library sizes
dge <- estimateDisp(dge, design, robust=T) 

## To perform quasi-likelihood(QL) F-test tests:  bulk RNA-seq 
fit <- glmQLFit(dge, design, robust=T)  #拟合模型 
lt <- glmQLFTest(fit, contrast=c(-1,1)) #统计检验#注意比对顺序:实验-1 /对照1

## To perform likelihood ratio test：  scRNA-seq and no replicates data
# fit <- glmFit(dge, design, robust=T)
# lt <- glmLRT(fit, contrast=c(-1,1))  #比对:顺序实验/对照，已设对照为1

tempDEG <- topTags(lt, n = Inf) #sort by PValue, n is the number of genes/tags to return
tempDEG <- as.data.frame(tempDEG)
DEG_edgeR <- na.omit(tempDEG)

3. limma

limma进行差异分析有两种方法 ：limma-trend和voom，在样本测序深度相差不大时两种方法差距不大，而测序深度相差大时voom更有优势，因此我们一般都选择voom的方法进行差异分析。Limma-voom vs limma-trend (bioconductor.org)

library(limma)
library(edgeR)

#分组矩阵design构建
design <- model.matrix(~0+factor(group_list)) #构建分组矩阵
colnames(design) <- levels(factor(group_list))
rownames(design) <- colnames(counts)

## 表达矩阵DGEList构建与过滤低表达基因
dge <- DGEList(counts=counts) 
keep.exprs <- filterByExpr(dge,design=design) #过滤低表达基因
dge <- dge[keep.exprs,,keep.lib.sizes=FALSE] 
dge <- calcNormFactors(dge)  #归一化基因表达分布,得到的归一化系数被用作文库大小的缩放系数
cont.matrix <- makeContrasts(contrasts=paste0(exp,'-',ctr), #比对顺序实验/对照
                             levels = design)

## DE分析  limma-trend（logCPM,有相似文库大小）  or  voom（文库大小差异大）
# de <- cpm(dge, log=TRUE, prior.count=3)  #如选择logCPM，则eBayes设trend=TRUE
de <- voom(dge,design,plot=TRUE, normalize="quantile")
fit1 <- lmFit(de, design)               #线性拟合
fit2 <- contrasts.fit(fit1,cont.matrix) #统计检验
efit <- eBayes(fit2, trend=F)  #Apply empirical Bayes smoothing to the standard errors

tempDEG <- topTable(efit, coef=paste0(exp,'-',ctr), n=Inf)  #padj值从小到大排列
DEG_limma_voom  <- na.omit(tempDEG)

4. 保存DEG数据

#### 保存DEG数据 ####
save(DEG_limma_voom,DEG_DEseq2,DEG_edgeR,
       file ='test_DEG_results.Rdata') 
  
  #### 合并三种DEG文件交集至csv
  allg <- intersect(rownames(DEG_limma_voom),rownames(DEG_edgeR))#取交集
  allg <- intersect(allg,rownames(DEG_DEseq2))
  ALL_DEG <- cbind(DEG_limma_voom[allg,c(1,4,5)],
                                 DEG_edgeR[allg,c(1,4,5)],
                                 DEG_DEseq2[allg,c(2,5,6)]) 
  colnames(ALL_DEG)
  colnames(ALL_DEG) <- c('limma_log2FC','limma_pvalue','limma_padj',
                         'edgeR_log2FC','edgeR_pvalue','edgeR_padj',
                         'DEseq2_log2FC','DEseq2_pvalue','DEseq2_padj')
  write.csv(ALL_DEG,file = 'test_DEG_results.csv')

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二、3种差异分析结果比较

由于本次样品两组间差异十分显著，差异基因很多，因此筛选阈值调整为：FoldChang=10，padj=0.001。一般情况下选择FoldChang=1.5~4，padj<=0.05即可，根据样本情况而定。
下面查看三种差异分析结果的相关性和差异基因的重叠情况。

#### 比较一下三种DEG方法结果 ####
load(list.files(pattern = 'DEG_results.Rdata'))
a <- read.csv(file = list.files(pattern = 'DEG_results.csv'),header = T,row.names = 1)

#查看相关性、一致性
colnames(a)
print(cor(a[,c(1,4,7)])) 

#查看显著差异基因重叠性，绘制韦恩图
#BiocManager::install("RBGL") #安装依赖包
#install.packages("Vennerable", repos="http://R-Forge.R-project.org") #安装Vennerable包
library(Vennerable) 

log2FC_cutoff=log2(10);  p_cutoff=0.001   #筛选显著差异基因比较
if(T){#根据Padj筛选
DEseq2_deg <- rownames(DEG_DEseq2[with(DEG_DEseq2,abs(log2FoldChange)>log2FC_cutoff & padjlog2FC_cutoff & FDRlog2FC_cutoff & adj.P.Val

从以下图中可以看出，三种方法所得结果相关性很高，都在0.99以上，显著差异基因的重叠也很高。

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三、选取差异基因绘制火山图和热图

以下示范选取DESeq2差异分析结果进行绘制, 筛选阈值设置为：FoldChang=10，padj=0.001

1. 火山图的绘制

library(ggplot2)
library(pheatmap)
##筛选条件设置
log2FC_cutoff = log2(10)
padj_cutoff = 0.001
##选取差异分析结果
need_DEG <- DEG_DEseq2[,c(2,6)] #选取log2FoldChange, padj信息
colnames(need_DEG) <- c('log2FoldChange','padj') 

need_DEG$significance  <- as.factor(ifelse(need_DEG$padj < padj_cutoff & abs(need_DEG$log2FoldChange) > log2FC_cutoff,
                                           ifelse(need_DEG$log2FoldChange > log2FC_cutoff ,'UP','DOWN'),'NOT'))

title <- paste0(' Up :  ',nrow(need_DEG[need_DEG$significance =='UP',]) ,
                     '\n Down : ',nrow(need_DEG[need_DEG$significance =='DOWN',]),
                     '\n FoldChange >= ',round(2^log2FC_cutoff,3))

g <- ggplot(data=need_DEG, 
            aes(x=log2FoldChange, y=-log10(padj), 
                color=significance)) +
  #点和背景
  geom_point(alpha=0.4, size=1) +
  theme_classic()+ #无网格线
  #坐标轴
  xlab("log2 ( FoldChange )") + 
  ylab("-log10 ( P.adjust )") +
  #标题文本
  ggtitle( title ) +
  #分区颜色                  
  scale_colour_manual(values = c('blue','grey','red'))+ 
  #辅助线
  geom_vline(xintercept = c(-log2FC_cutoff,log2FC_cutoff),lty=4,col="grey",lwd=0.8) +
  geom_hline(yintercept = -log10(padj_cutoff),lty=4,col="grey",lwd=0.8) +
  #图例标题间距等设置
  theme(plot.title = element_text(hjust = 0.5), 
        plot.margin=unit(c(2,2,2,2),'lines'), #上右下左
        legend.title = element_blank(), #不显示图例标题
        legend.position="right")  #图例位置

ggsave(g,filename = 'volcano_padj.pdf',width =8,height =7.5)

2. 热图的绘制

##选择要展示基因表达量的数据
# dat <- log2(edgeR::cpm(counts)+1) 
dat <- log2(tpm+1)
# dat <- read.table("../2.check/Deseq2_rld.txt"); colnames(dat) <- rownames(gl)  #R读取数据列名可能会出错，需要重新对应一下

gene_up <- rownames(need_DEG[with(need_DEG,log2FoldChange>log2FC_cutoff & padj

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到此就完成了基因差异分析的基本过程，得到了不同分组间的差异基因相关信息，接下来就要对差异基因进行富集分析啦

参考资料
三种R包的官方说明书：
RNA-seq workflow: gene-level exploratory analysis and differential expression (bioconductor.org)
Analyzing RNA-seq data with DESeq2 (bioconductor.org)
edgeR: differential analysis of sequence read count data User's Guide (bioconductor.org)
limma usersguide.pdf (bioconductor.org)
bioconductor的worlk flow：
使用limma、Glimma和edgeR，RNA-seq数据分析易如反掌 (bioconductor.org)
部分代码修改参考自：
GitHub - jmzeng1314/GEO
【生信技能树】转录组测序数据分析_哔哩哔哩_bilibili
【生信技能树】GEO数据库挖掘_哔哩哔哩_bilibili

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RNA-seq实战系列文章：
RNA-seq入门实战（零）：RNA-seq流程前的准备——Linux与R的环境创建
RNA-seq入门实战（一）：上游数据下载、格式转化和质控清洗
RNA-seq入门实战（二）：上游数据的比对计数——Hisat2+ featureCounts 与 Salmon
RNA-seq入门实战（三）：从featureCounts与Salmon输出文件获取counts矩阵
RNA-seq入门实战（四）：差异分析前的准备——数据检查
RNA-seq入门实战（五）：差异分析——DESeq2 edgeR limma的使用与比较
RNA-seq入门实战（六）：GO、KEGG富集分析与enrichplot超全可视化攻略
RNA-seq入门实战（七）：GSEA——基因集富集分析
RNA-seq入门实战（八）：GSVA——基因集变异分析
RNA-seq入门实战（九）：PPI蛋白互作网络构建（上）——STRING数据库的使用
RNA-seq入门实战（十）：PPI蛋白互作网络构建（下）——Cytoscape软件的使用
RNA-seq入门实战（十一）：WGCNA加权基因共表达网络分析——关联基因模块与表型