十月份发表在《nature communication》上的一篇关于神经内分泌癌（NEC）的研究，根据神经转录因子ASCL1和NEUROD1的表达，揭示了两种不同的NEPC亚型，虽然在细胞系和人类肿瘤抑制模型（PDX）中，这些亚型是相互排斥的，但对人类临床样本的单细胞分析显示出更复杂的肿瘤结构，亚型在同一肿瘤中作为独立的亚群共存。这些肿瘤亚群在遗传和表观遗传上的差异导致了人类转移瘤内和肿瘤间的异质性，这一研究可以有效的为临床提供更有效地治疗策略。
摘要：
神经内分泌癌(NECs)是一种高级别肿瘤，可发生在肺、结肠、前列腺或膀胱等解剖部位。NECs的特点是侵袭性临床行为和不良预后。在组织形态学上，NEC包括一组具有小细胞癌特征的肿瘤，并表现出神经内分泌(NE)标志物，包括SYP、CHGA和INSM12的表达。鉴于这些共同特征，NECs构成了独特的临床病理实体，尽管它们的解剖学起源不同。从遗传学的角度来看，NECs通常以RB1和TP53的基因组的畸变为特征。
默克尔细胞癌(MCC)：RB1和TP53改变与NEC病因的关联在默克尔细胞癌(MCC)中得到了证实。MCC通常是由默克尔细胞多瘤病毒DNA的克隆整合引起的，这导致病毒T抗原的持续表达，干扰RB14 (MCC多瘤病毒阳性)。
胃肠道神经内分泌癌：胃肠道NEC (GINEC)通常也含有TP53和RB1改变，与分化良好的胃肠道类癌相比，在临床上具有侵袭性和高增殖性，虽然也显示神经内分泌表型，但在临床上通常是惰性的，与TP53和RB1改变无关。NEC可以是新生的，也可以是治疗压力的结果。
小细胞肺癌：小细胞肺癌(SCLC)最常发生在新生阶段，但也可在EGFR突变型肺腺癌(AD)治疗后出现。根据基本螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子(TFs) ASCL1和NEUROD17的差异表达，SCLC被进一步分类。这些神经元谱系的TFs (LTFs)与lung8,9的常驻NE细胞的成熟有关。它们也参与了致癌过程，如SCLC小鼠模型所示，其中ASCL1是肿瘤形成所必需的。
神经内分泌前列腺癌：神经内分泌前列腺癌(NEPC)最常作为一种治疗突发性表型出现，在前列腺ADs治疗后抑制雄激素受体(AR)通路活性，并且很少发生新生。NEPC预后差，治疗选择非常有限，目前作为同质疾病治疗。
在这里，我们展示了一系列NECs的染色质谱，并确定收敛到一个共同的表观遗传状态。发现在治疗紧急的NEPC中存在与新发SCLC中所描述的一致的亚型。在相同的人类NEPC标本中，这些亚型作为具有不同染色质状态的独立亚群共存。观察到的临床NEPC样本的肿瘤内异质性具有治疗意义。
结果：
神经内分泌癌NECs有一个共同的DNA可访问区域
在组织形态学上，NECs表现出相似之处，这可能是由共同的转录调控因子激活引起的。为了研究染色质可及性对NEC表型的影响，研究人员利用高通量测序(ATACseq)和RNA测序(RNA-seq)分析在不同解剖位置产生的NECs的表观遗传格局，并将其应用于患者的NEPC、SCLC和MCC异种移植(PDX)模型，以及GINEC的临床样本。由于NEC可以从既存的腺癌中产生，以NEPC为典型，偶尔也有SCLC，我们假设这些组织学是肿瘤进展谱的极端。为了通过ATAC-seq分析确定神经内分泌癌和腺癌之间染色质状态的差异，我们还生成了转移性前列腺癌 (PRAD) PDX模型的数据，并使用了癌症基因组图谱数据用于原发性PRAD和非小细胞肺腺癌。对ATAC-seq数据进行的无监督主成分分析(PCA)显示，与解剖位点分离的腺癌相比，NECs聚类在一起，表明染色质处于收敛状态(图a)。为了验证这一结果，研究人员还分析了之前发表的ATAC-seq结果，这些结果来自于表达特定致癌驱动程序集的工程细胞，这些细胞将正常基底前列腺细胞重新编程为NE状态。数据集的ATAC-seq峰的样本样本相关性也支持这样的结果，即来自同一组织的NECs彼此之间比它们的腺癌对应物更相似(图b)。为了研究参与NE染色质状态的表观遗传驱动因素，研究人员对腺癌和NECs之间的DNA可及性进行了监督分析，发现腺癌和NECs之间的DNA可及性较高，并发现所有神经内分泌肿瘤类型共享的特异性可访问位点(图c)。在前列腺细胞中也可以看到nec特异性染色质标记，在神经内分泌特异性可达位点上信号明显增加，而在腺癌特异性位点上信号很少或没有。我们还确定了与每个位点最近的基因，并将ATAC标记翻译成RNA-seq标记，发现我们可以在患者队列中区分去雄抵抗前列腺癌(CRPC)和NEPC，进一步验证了PDX模型的签名。
通过基因组区域富集注释工具(GREAT)分析，将基因组区域与附近的基因关联起来，然后检测基因本体(GO)路径的富集，进一步研究了腺癌和NECs之间染色质组织的主要差异。神经内分泌特异性dna可达区域附近的基因在神经分化、发育、形态和轴突发生的通路上显著富集(图1d)。接下来，研究人员使用HOMER研究了富集TF dna结合基板的特异性位点。该分析显示，bHLH TF家族的基本基元显著富集，特别是对ATOH1、ASCL1和NEUROD1，以及对NFIB、SOX2和NKX2-1基元显著富集(图e)。而ASCL1和NEUROD1则被认为在sclc中具有相应的作用。NFIB是一种TF，此前与SCLC22的染色质结构重组有关，而SOX2和NKX2-1也已知与sclc有关。研究ATAC-seq峰中哪些基元共同出现，我们观察到三个主要基元模块(ASCL1、ATOH1和NEUROD1)与SOX2或NFIB或两者同时出现的情况非常频繁。通过将神经内分泌特异性位点与cisstromeDB中已发表的染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)谱进行比较，确定了已发表的结合位点与GIGGLE评分所量化的神经内分泌特异性ATAC-seq峰重叠程度最高的TFs。与观察到的NECs共享表观遗传程序一致，顶部重叠的ChIP-seq数据集来自SCLC、MCC或神经谱系(图f)。特别是，ASCL1 (SCLC)、NEUROD1 (SCLC和髓母细胞瘤)和MAX (MCC)的结合谱与神经内分泌特异性可及染色质重叠评分最高(图1f)。接下来，研究人员分析了在研究样本中这些tf和其他nec相关因子的表达。正如预期的那样，研究人员观察到NE标记(SYP, CHGA和INSM1)和茎干TF SOX2(图g)在NECs中的表达有很强的共性。研究人员还观察到在NEPC和SCLC中包括ASCL1或NEUROD1在内的bHLH TFs的更互斥的表达模式，GI-NECs中ASCL1和ASCL2的表达，MCC中ATOH1的表达(图g)。总的来说，研究人员的研究结果表明肿瘤和器官特异性bHLH转录因子维持着常见的NE表观遗传状态。
治疗后的NEPC可根据ASCL1和NEUROD1的表达进行细分
为了探索转录因子(TF)调控NEC表观遗传状态的异质性，研究人员对局限于NECs的ATAC-seq数据进行了无监督分析。SCLC和NEPC在DNA可及性方面的相似性取决于ASCL1或NEUROD1表达的状态，而不是肿瘤类型。仅在前列腺样本中对DNA可及性的无监督分析(图a)显示出与AR(所有神经内分泌前列腺癌)、ASCL1或NEUROD1表达相关的明确聚类分组，通过分析这些相同前列腺样本的RNA-seq数据也可以看出相同的聚类。接下来，我们旨在鉴定与ASCL1和NEUROD1 NEPC亚型相关的差异DNA。通过监督分析比较表达NEPC的ASCL1和NEUROD1样本，发现了8950个ASCL1-和12751个NEUROD1-特异性可及区域(图b)。接下来，我们调查了SCLC中的NEPC亚型特异性位点，并在这些tf特异性基因组区域观察到类似的染色质可及性模式，此外，还发现染色质状态与ASCL1和NEUROD1的差异表达之间存在关联。值得注意的是，ASCL1和NEUROD1共同表达的SCLC病例在两组区域显示联合可达性。这一结果强调了肿瘤亚型的染色质状态的惊人相似性，包括SCLC和NEPC。值得注意的是，尽管这两种亚型在可及性方面存在明显差异，但鉴于两种亚型具有共同的NE特征，正如预期的那样，这两种亚型之间仍有大量的开放染色质位点共享。
为了进一步研究不同亚型间的染色质差异，我们研究了TF亚型特异性染色质可及性与ASCL1和NEUROD1基因组结合之间的关系。差异染色质可及位点被相应的TF结合，而不是被另一个TF结合(图b)。这一结果与ASCL1和NEUROD1在各自亚型中维持染色质状态的作用一致。接下来，研究人员利用来自相同样本的表达数据，试图确认针对ASCL1和NEUROD1亚型的增强子与附近基因的表达相关(图c)。正如预期的那样，差异表达分析显示ASCL1是ASCL1组中上调最多的基因之一，而相反，NEUROD1组显示包括NEUROD1/2/4/6在内的多个NEUROD家族成员上调(图c)。与这些差异可及区域的功能一致，观察到差异DNA可及性和差异基因表达之间存在显著关联(图c)。基因集富集分析以识别两种亚型中不同程度过度表达的通路，结果显示ASCL1相关的基因表达在细胞因子28反应的GO通路中富集，而neurod1相关的表达在脑发育通路中富集(图d)。在ASCL1亚型中特别富集的是癌胚抗原相关细胞粘附分子(CEACAM1,5,6,7)。有趣的是，CEACAM5已经被研究使用一种antieacam5 - sn38抗体偶联剂靶向NEPC。此外，与NEUROD1亚型相比，ASCL1亚型表现出相对较高的主要组织相容性复合体i相关基因(人类白细胞抗原基因，NLRC5)的表达，这可能有助于富集与ASCL1相关的免疫途径。然而，相对于CRPC中的表达，其表达仍然很低。因此，与其他NECs类似，这两种亚型NEPC均表现出相对较低的抗原提呈途径表达。ASCL1和NEUROD1转录因子与自身启动子和附近增强子的结合表明，它们在NEPC中作为LTF发挥作用。已知LTF通过与超级增强子(SEs)结合建立一个正反馈循环来自动激活自己的表达。此外，LTFs形成核心tf的回路，由促进维持谱系所需的转录程序的SEs激活驱动。ASCL1和NEUROD1都是已知的神经系统转录因子。调查的潜在LTF行为都在NEPC TFs,我们执行SE分析由ASCL1 H3K27ac剖析和NEUROD1 NEPCs,并发现所有的模型显示,常见的TFs SE激活各种肿瘤亚型(图e)。此外,我们发现ASCL1或NEUROD1(以及其他家族成员)的不同SEs与它们的表达状态一致。基于这些特点,ASCL1和NEUROD1都可以被视为LTFs与绑定NEPC SEs并激活自己的表达式(图c、f)。接下来，我们使用前面描述的方法识别相互关联的自动调节回路，识别与两个子类型各相关的tf的核心电路。我们在这两种亚型中发现了不同但高度重叠的TF通路(图g)。综上所述，我们的结果为NEPC模型系统中存在两种分子亚型提供了明确的证据。这些亚型具有相同的NE表型特征，但ASCL1和NEUROD1的表达不同，这与不同的染色质结构和基因表达谱有关。
NEPC肝转移瘤的异质性分析
接下来，研究人员为了去确定模型系统的结果是否可以扩展到人类临床NEPC。首先调查了两组NEPC转移肿瘤组织中ASCL1和NEUROD1的表达水平。与之前在NEPC PDXs中观察到的两个TFs相互排斥的表达相反，临床样本显示了一系列的共表达。在大多数转移灶中ASCL1表达较高，同时几乎所有病例中NEUROD1表达较低且更多变(图a)。临床NEPC样本中TFs的差异表达与我们比较ASCL1和NEUROD1 NEPC模型中识别的相应基因标记的富集有关。
为了研究这些tf是否在相同的肿瘤细胞或不同的肿瘤亚群中共同表达，研究人员研究了5个不同的肝转移(FLMs)片段，这些片段来自于一名确诊为NEPC的患者的尸检，可用最佳切割温度化合物冷冻和福尔马林固定石蜡包埋材料，并使用RNAseq来评估ASCL1和NEUROD1的表达水平。这些水平显示了两种TFs的共表达范围，其中FLM3显示了NEUROD1与ASCL1的最高相对表达。接下来，对FLM3上的ASCL1和NEUROD1蛋白表达进行免疫组化(IHC)分析。ASCL1和NEUROD1染色显示了肿瘤内的异质性，定义了两个分离的肿瘤群体，它们存在于肿瘤切片的不同部位(图b)。这两种亚型都表现出NE表型，其特征是NE标记INSM1的表达和AR表达的缺失。与组织形态学特征的相关性表明，两种不同的细胞群在组织学特征上也存在差异。ASCL1阳性细胞呈片状生长和梭形细胞形态，而neurod1阳性细胞似乎生长在更小的细胞簇中，具有明显的核模塑和局灶多形性巨细胞(图c)。研究人员将IF分析扩展到另外6个NEPC样本，也观察到存在相同类型的肿瘤内异质性，没有ASCL1和NEUROD1共表达。
接下来，研究人员通过单细胞染色质(scATAC-seq)和表达(单核RNA测序(snRNA-seq))分析研究了两个观察到的肿瘤内群体。选择NEUROD1表达最高的FLM3和表达最低的FLM5，几乎是ASCL1的200倍。从FLM3冰冻切片中分离细胞核，并进行scATAC-seq和snRNA-seq，将ASCL1和NEUROD1的表达与相应的染色质状态联系起来。scat -seq的无监督t分布随机邻居嵌入(tSNE)聚类生成多个聚类，分析了在SOX2启动子上的差异可及性，以区分肿瘤细胞和正常细胞。根据对SOX2的可及性，肿瘤细胞的比例约为80%。值得注意的是，可以根据ASCL1和NEUROD1启动子的不同可及性来区分对应于两种肿瘤亚型的簇。ASCL1和NEUROD1簇在大容量分析确定的最高ATAC差异区域也显示出不同的可及性。另外一组由在ASCL1或NEUROD1启动子处显示可访问性但混合的细胞组成;我们将该簇标记为混合。接下来，我们分析snRNA-seq以识别表达ASCL1和NEUROD1的肿瘤细胞，然后使用SEURAT34将该数据集与scATAC-seq整合(图d)。这种整合可以基于特定标记的表达来分配正常的细胞。至关重要的是，从大量数据发展而来的具有ASCL1或NEUROD1可及性特征的细胞优先表达相应的TF(图d)。结果表明，ASCL1和NEUROD1亚型作为独立的亚群体存在，与它们各自的模型系统中具有相似的表观遗传特征。接下来研究人员研究了FLM5样本，它通过scATAC-seq分析具有最高的ASCL1表达。根据RNA-seq, tSNE分析显示，在ASCL1启动子处有一个FLM5肿瘤细胞聚类，但在NEUROD1处没有。FLM3和FLM5的综合scATAC分析显示，99%的FLM5肿瘤细胞重叠于FLM3 ASCL1簇(图e)，表明这些细胞具有相同的染色质可及性。接下来，研究人员在图2a中模型系统定义的PCA空间中绘制FLMs通过TF聚类聚合的scATAC-seq，这进一步验证了原代组织中两个亚型的染色质状态(图f)。总之，这些结果都表明了，人类NEPC转移的亚型异质性，这些亚型显示出与模型系统中观察到的相似的明显表观遗传特征。
在患者转移中，NEPC亚型是不同的但仍然相关的克隆
接下来，研究人员试图使用全外显子组测序(WES)和拷贝数变异(CNV)从ATAC-seq数据来研究NEC样本的遗传特征。从大量ATAC-seq数据推断RB1基因状态显示，在所有NEPC PDX模型中均存在双等位基因缺失，但在腺癌前列腺癌(ADPC)模型中没有。通过FLM3和FLM5的tSNE分析，将同样的方法应用于全基因组的scat-seq簇。结果显示，这些簇的cnv总体上具有相似性(图a)。例如，在ASCL1和NEUROD1簇中观察到所有的chr16和部分chr2和chr13杂合子缺失。此外，我们发现在两个簇中，在chr10的PTEN上都有一处杂合子缺失。然而，存在明显的CNV差异，包括chr14p和chr7p扩增20 MB，仅存在于NEUROD1簇。值得注意的是，FLM3中ASCL1成分的CNVs与FLM5中的ASCL1聚类显示出几乎相同的特征，而与同一片段内的NEUROD1聚类显示出较低的相关性(图b)。虽然FLM样本来自大块组织，但WES分析验证了scacc-seq推断的CNV改变，包括chr14p和chr7p的扩增。最后，我们将FLM3的CNV分析扩展到单细胞水平。k值意味着基于CNVs的细胞聚类区分了三个簇:一个对应于正常细胞，没有变化，另外两个簇显示变化。另一组细胞在chr7p和chr14p有扩增，与NEUROD1类型相关，第三组细胞没有与ASCL1类型相关的改变(图d)。接下来，研究人员在该样本的scATAC-seq tSNE图中标记来自遗传分析中定义的三个集群的细胞的身份，并显示出与表观遗传分析定义的分组的强烈对应(图e)。重要的是，这种单细胞分析加强了对scATACseq分析中识别的混合聚类的解释，表明它对应于混合的ASCL1和NEUROD1克隆，而不是一个独立的克隆。结果显示，在该患者中存在与两个NEPC表观遗传亚型相关的不同遗传克隆，考虑到它们的大量CNV谱重叠，可能来自一个共同祖先。
文章小结：
简单的四张图，从存在于多种癌症的神经内分泌腺癌中发现了两种基因作为标签的两种亚群，再根据实验验证和单细胞数据分析去进一步研究肿瘤异质性，又使用全外显子组测序(WES)和拷贝数变异(CNV)从ATAC-seq数据来研究NEC样本的遗传特征，为亚型相关研究提供了更多的研究思路。
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