E1E3 负责C3位脱氧的酶

scheme5

化合物10转化为11由两个酶完成，CDP-6-deoxy-L-threo-D-glycero-4-hexulose 3-dehydratase (E1) and its reductase (E3) (Scheme 1)。

C3 位脱氧是生物合成ascarylose 3最复杂的一步。Yersinia pseudotuberculosis 来源的酶在大肠杆菌中异源表达Extensive mechanis

Yersinia pseudotuberculosis来源的野生型的E1是一个同型二聚体，含有一分子PMP辅酶，这个辅酶和活性中心非共价结合。其活性中心还含有一个[2Fe-2S]簇。

E3是一个单体，其含有一分子FAD和一个植物类型的[2Fe-2S]簇(UV EPR Fe S含量测定)。E3和其他含有铁硫簇的黄素蛋白同源，属于FNR家族。这个酶可以将NADH的H转移给O2 FMN FAD DCPIP。铁硫簇负责将H质子从E3转移到E1。E3可以被DTNB NEM失活，其中，Cys75 Cys296是这两个试剂的失活位点。这两个残基分别临近[2Fe-2S]簇和E3 NADH的结合位点。H质子的转移认为是pro-R专一的。

E1和B6依赖的酶高度同源，但是有两个重要区别。B6依赖的酶中，具有保守的lys 可以和PLP形成希夫碱，E1中没有，在E1 220位是His 而不是Lys. 并且，E1还有一个特殊的铁硫簇，使得E1区别于PLP依赖的酶，是一个PMP依赖的脱水酶。如上图scheme5所示，C3位的脱氧起始于化合物10与PMP脱水形成希夫碱，并且370-410nm 有希夫碱的特征吸收。CDP-[U14C 3-3H]-六碳糖与E1孵育，未发现3H的转移，说明C3位没有去质子化的步骤。事实上，PMP-pro- S 4-H的离去以及电子的转移导致C3位羟基的离去，生成了中间体22。His220是活性中心的碱，负责攫取PMP-pro- S 4-H，导致C3位 CO键的断裂。E1突变体 H220N 并没有完全丧失活性，可能因为His221拯救了酶的活性。E1突变体H220N/H221N 完全丧失了活性。[18O]H2O实验发现18O插入到糖的C3位置，说明生成中间体22是一个可逆反应。中间体22会继续被E3的NADH还原。其他的还原酶也可以还原中间体22，如硫辛酰胺脱氢酶，甲烷单加氧酶还原酶，还原效率低于E3。结果是C3位的羟基被来源于溶剂的H取代，并保留了构象。

如图scheme5所示，E1催化中最初的脱水是由阴离子诱导引发的，这个阴离子中间体有维生素B6稳定。中间体22由来自于E3的NADH还原。铁硫簇是存在于E1 E3的负责单电子转移的辅酶，表明在E1 E3中有自由基的参与。