Nat Biotech | 埃米级定位揭示细胞更多细节
原创 骄阳似我 图灵基因 2022-11-18 10:37 发表于江苏
收录于合集#前沿分子生物学技术
撰文：骄阳似我
IF： 68.164
推荐度：⭐⭐⭐⭐⭐
亮点：
1、超分辨率技术在纳米范围实现了定位精度。本文报告了在埃米范围内的全光学，室温定位。本文建立在MINSTED纳米镜的概念上，通过用受激发射耗尽（STED）环形光束的低强度中心区域包围荧光团，同时不断增加环形光束的绝对功率，从而提高精度。
2、通过蓝移STED光束和开启/开关分离荧光团，与DNA链结合的单个荧光团用σ = 4.7 Å
定位，对应于荧光团大小的一小部分，只有2000个检测光子。通过瞬时DNA杂交成像和哺乳动物细胞中核层膜的分布，模拟了具有个数纳米分辨率的MINSTED荧光纳米镜。
3、本文实验产生了一个定位精度的σ = 2.3 Å估计有10,000个检测光子，预计这将为细胞中大分子复合物的研究开辟新的应用领域。
自20世纪70年代以来，荧光显微镜一直是研究细胞中生物分子分布必不可少的手段。在本世纪之交，STED显微镜打破了衍射屏障，对光学分辨率施加了明显无法克服的物理限制，打开了几十纳米尺度的细胞成像。通过依赖荧光团荧光能力的开关，这种转变成为可能。最近引入的MINFLUX和MINSTED纳米镜又增加了10倍，从而最终达到了荧光标签尺度上的分辨率。
近期，在Nature Biotechnology杂志上发表了一篇名为“MINSTED nanoscopy enters the Ångström localization range”的文章，报告了MINSTED获得全光学荧光团定位的精度在埃米范围。对应于荧光团大小的一部分，这些精度是在室温下使用STED显微镜获得的。DNA链上的单个荧光团用σ = 4.7 Å进行定位，通过将单个发射轨迹分成2000个光子的重叠块来测量。对于在这些痕迹中实际探测到的总共10,000个光子，估计了一个精确的σ = 2.3 Å。在DNA杂交标记的哺乳动物细胞中成像核孔MINSTED纳米镜，该方法称为DNA PAINT。在大鼠海马神经元中突触蛋白分布的MINSTED图像中也获得了类似的分辨率。这些进步之所以成为可能，是因为与标准的STED不同，MINSTED纳米镜一次只使用一个开启状态的荧光团，而焦点区域的所有其他荧光团都是关闭的。此外，只有一个活性荧光团就可以使STED更有效地实现，从而有利于最终的概念。
本文研究背后的物理原理可以概述如下（图1）。在几乎所有的STED显微镜中，λSTED被调谐到荧光光谱的非常红色的边缘。对于发出红橙色的荧光团，通常选择流行的近红外λSTED= 775 nm。原因是，在室温下，大多数荧光团的激发光谱深入延伸到发射峰。因此，λSTED较短的STED环形光束倾向于“直接”激发抗Stokes模式下的许多旁观者荧光团，从而在环形区域产生大量荧光。因此，这种荧光影响了荧光团分离所需的开关对比度（图1b，c）。随着受激发发射的荧光团横截面ς随发射光谱的变化，将λSTED远移到红色边缘会降低ς，从而降低每单位STED光束功率的STED效率。随着功率的增加来补偿ς的减少，显然有（热负荷）限制，当在最好的尺度上定位时变得明显。
然而，当开/关对比度由STED以外的过程提供时，就像当单个荧光团在活性和非活性状态之间切换时一样，λSTED可以被调谐到更接近发射最大值，从而使ς变得更大。在这种情况下，STED环形光束“直接”激发引起的背景并不重要，因为所有的荧光团，除了被定位的荧光团，都是不活跃的（图1c）。较大的ς使较低的STED光束功率，从而避免禁止加热，并使用脉冲二极管激光器（图1d）。图1：蓝移MINSTED。
蓝移λSTED也改变了光学装置的有效点扩散函数（E-PSF）（图1b)。E-PSF是λEXC（和λSTED）激发和λSTED去激发的归一化概率的乘积，代表荧光团在焦点区域某一坐标发射的概率。一般情况下，随着ς和环形光束强度的增加，E-PSF的半最大值全宽（FWHM）变窄。另一方面，由于环形光束的“直接”激发，蓝移的λSTED导致了一个基座（图1b）。虽然这种基座影响了整体STED成像（图2a，b），但在处理单独发射体时，这并不重要。
对于发射峰值在≈为570nm的荧光团Cy3B，本文实现了λSTED = 636 nm，使ς达到其全球最大值的28%。这应该与将流行的λSTED = 775 nm应用于Atto647N等红色发射荧光团时获得的≈5%形成对比。共对准的λEXC = 560 nm激发和STED光束，分别具有电子同步脉冲200 ps和1.4ns的脉冲，通过1.4数值孔径的油浸物镜聚焦到样品中。因此，在STED脉冲能量为1 nJ时，获得了一个24nm横向FWHM的E-PSF（图2c，d）。相比之下，在λSTED =为775 nm处，需要≈为10nJ的脉冲才能获得与Atto 647N相同的FWHM。在使用的10mhz重复频率下，这种蓝移导致平均STED光束功率从100 mW减少到10 mW，从而大大降低了热负荷。注意，将FWHM从共聚焦持续调整到最小FWHM是每个MINSTED荧光团定位的一个组成部分。图2：蓝移STED的对比度和分辨率。
为了通过开/关开关进行分离，首先选择了在被称为DNA PAINT的方法中实现的机制：通过DNA杂交，荧光团与感兴趣的生物分子目标的瞬时结合。当荧光团与目标结合，从同一坐标发出时，它处于“打开”。相反，当荧光团在周围的介质中扩散时，它就会“关闭”，只产生一个微弱的背景（图3）。这种通过结合和扩散进行的开/关调制使能够避免光可激活和光可切换的荧光团，而是使用常规的荧光团，特别是Cy3B。
因此，PAINT允许使用首选的波长上非常适合STED的染料。DNA PAINT的开/关调制也使多次测量单个结合位点成为可能，这有助于对单个结合位点的定位精度进行统计分析。一般来说，STED与DNA杂交标记的结合具有高度的协同作用，因为当定位结合的荧光团时，STED环形光束抑制了扩散荧光团的背景。STED的使用只是通过添加另一种断开机制来增加DNA标记的对比度。同样地，与标准的高分辨率DNA涂料应用相比，这种放大的关闭开关有利于使用更高浓度的扩散标签，从而可以加速成像。
为了量化蓝移MINSTED定位和纳米镜学，使用矩形DNA折纸阵列进行了测量，在12nm周期距离下为单个荧光团提供3×3结合位点。选择扩散Cy3B荧光团的浓度，每次只有一个荧光团对接到焦点区域内的网格点，而其他荧光团在溶液中自由扩散(图3b和4a-c）。首先验证了随着STED脉冲能量E的增加，信号-背景比（SBR）的增益（图3b）。为此，光栅扫描了2µm×2µm视场，激发平均功率为1.5µW。由单独结合的荧光团呈现的荧光峰值从结果图像中的荧光最大值中提取，而背景则从每像素的平均荧光信号中提取。
关闭激发光束使能够量化STED光束的“直接”激发。发现主要的背景成分确实是由于激发光束诱导了来自扩散荧光团的荧光。然而，随着STED脉冲能量E的增加，该成分迅速下降，因为环形光束限制了允许荧光的区域。STED束的“直接”激发随E的增加，但仍可接受（图3b）。总之，在1 nJ下得到的SBR = 60比标准共聚焦显微镜（E = 0）获得的SBR高10倍，也没有像典型的微流量最后定位步骤那样被牺牲，为高精度定位奠定了基础。图3：结合STED与开关和DNA杂交标记。
通过比较单定位估计σest和聚类分析精度σcluster，能够评估40分钟测量中结合位点的有效位置不确定性，作为过程中涉及的稳定性的代理。通过对σcluster (M) 进行建模，得到了一个s=为0.72 nm的值，证明了该系统的长期稳定性。精度和稳定性的结合使我们的蓝移MINSTED系统能够清晰地分辨出接近4 nm的折纸结合位点，这大约是Cy3B分子大小的两倍（图4b-f）。用L > Nc注册所有本地化解决了整个折纸模式。图4：MINSTED纳米镜定位精度和分辨率。
为了探索蓝移MINSTED纳米技术在生物样品中的性能，制备了表达核孔蛋白NUP96的哺乳动物（HeLa）细胞，作为sfGFP标记的多肽，作为抗GFP纳米体的结合位点。由于核孔复合体（NPC）在焦平面上的八倍对称性，像NUP96这样的NPC支架组件经常被用来评估纳米镜方法的性能。针对这些NUP96多肽的GFP标签的纳米体携带一条DNA对接链，与Cy3B荧光团的互补DNA链能够通过杂交结合，其中70%的图像估计中位数σ<为1nm（图5a-d）。
从数据集中手动选择所有可识别的NPC（328个NPC包含8116个定位，占数据集中所有定位的78%），并进一步分析它们的定位分布，得到的平均站点占用率为6.8个预计的八倍排列（图5e)。从这个数据集中，所有有8个被占据位点的NPC都被用于进一步分析，以确保沿孔隙轮廓的良好覆盖。在估计其椭圆度时，排除了所有长径比>1.25的NPC。从剩下的81个NPCs中，包括2361个定位，确定了平均直径为112±6nm（图5f）。
接下来研究了MINSTED图像如何与提供NUP96结构信息的三个低温电子显微镜（低温-em）数据集相匹配。每个NPC的32个全长NUP96多肽的x-y投影结构是根据它们与低温研磨的DLD-1 NPC的低温电子显微镜图的拟合进行排列的。附加标签所在的NUP96c端（氨基酸937）被突出显示（图5g)。从选择的81个NPC中，创建了一个叠加图像，复制了通过NUP96可视化的NPC的8倍对称性（图5h）。这个覆盖层被用来估计与从低温电子显微镜数据推导出的NUP96位置的拟合。
因为GFP纳米体实体是通过柔性连接肽附加到NUP96c端，它可以跨越旋转自由，一个二维（2D）可能的荧光团位置的圆形区域。在估计的平均长度为7 nm时，包括连接体、GFP和纳米体，其中68%的≈定位包含在这些区域内（图5i）。每个NUP96定位簇的细长外观沿着外围，如叠加图所示，可以解释为表明NUP96多肽在每个NPC的八角形亚基中轻微交错排列。考虑到可能的旋转半径为7 nm的荧光团位置，低温电子显微镜结构与MINSTED得到的数据很一致（图5j）。图5：核孔蓝移MINSTED成像。
通过这项测试后，MINSTED纳米镜被应用于没有表现出与NPC类似对称排列的结构。具体来说，用抗层膜A/C抗体标记COS-7细胞，这些抗体在靠近抗体结合袋的糖基化位点上有两条DNA对接链。对接链通过DNA杂交用于Cy3B标记。该抗体针对层膜蛋白A/C的Ig-fold结构域。记录荧光团及其位置68分钟，就得到了层膜分布的纳米级分布（图6a）。虽然该样品对分离和定位提出了更多的挑战，但估计的中位数σ为<1 nm。最后用一/二抗夹层标记突触蛋白2，应用MINSTED来观察培养大鼠海马神经元轴突末端密集的突触囊泡的分布。所得到的MINSTED图像显示了直径为38 ± 23 nm的荧光团簇，与代表突触囊泡的预期一致（图6b）。图6：层膜和突触囊泡的蓝移MINSTED成像。
总之，本文发现蓝移MINSTED能够用400个检测光子定位单个荧光团，σ = 1 nm，这是一个创纪录的低数量。需要注意的是，为了实现这种精度，理想的无背景质心定位需要≈11000个光子，这强调了以强度为零定位荧光团的好处。减少所需的检测数量也减少了运动和漂移的影响。接近4 nm的荧光团可以完全分离，还不需要进一步的数据后处理或漂移校正。这一成功是因为：(1) MINSTED以STED环形光束最小值提供样品中的参考坐标，(2)不断移动靠近荧光团，使去激发速率保持不变；(3) STED和共焦检测抑制荧光背景；(4)低功率光束可以避免通过加热而产生的细微干扰。
最后注意到所获得的精度记录仍然可以改进，而不修改最低限度的概念。由于检测率与二极管激光器的脉冲重复率成正比，将速率从目前的10 MHz增加到50-100MHz应该几乎相应地加快定位。随着激光技术的快速发展，这种情况可能很快就能在毫秒域内实现1nm精度的精确定位，从而适应更快的运动和漂移。同样地，具有1-Å精度的荧光团定位也应该成为一种常规方法。
教授介绍：
Stefan W. Hell
Stefan Hell，全称Stefan Walter Hell，（1962年12月23日出生于罗马尼亚阿拉德），罗马尼亚出生的德国化学家，因使用荧光分子绕过光学显微镜固有的分辨率限制而获得2014年诺贝尔化学奖。他与美国化学家W.E. Moerner和美国物理学家Eric Betzig分享了该奖项。
1978年，Stefan Hell和他的家人从罗马尼亚移民到德国。他在海德堡大学学习物理学，1987年获得文凭，1990年获得博士学位。从1991年到1993年，他是海德堡欧洲分子生物学实验室的博士后研究员，从1993年到1996年，他是芬兰图尔库大学激光显微镜小组的首席科学家。他于1997年回到德国，成为哥廷根马克斯普朗克生物物理化学研究所的研究小组组长。2002年，他成为该研究所所长。
参考文献：
Weber, M., von der Emde, H., Leutenegger, M.et al.MINSTED nanoscopy enters the Ångström localization range.Nat Biotechnol(2022). https://doi.org/10.1038/s41587-022-01519-4