代谢组学常用分析方法

代谢组学是效仿基因组学和蛋白质组学的研究思想,对生物体内所有代谢物进行定量分析,并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究。代谢组学的研究需要高灵敏度、高通量且稳定性好的方法,所以检测平台的选择也是至关重要,今天小析姐就和大家聊一聊代谢组学和代谢组学的研究检测技术。

我 们知道细胞内的生命活动由众多基因、蛋白质、以及小分子代谢产物来共同承担,而上游的(核酸、蛋白质等)大分子的功能性变化最终会体现于代谢层面,如神经递质的变化、激素调控、受体作用效应、细胞信号释放、能量传递和细胞间通讯等,所以代谢组处于基因调控网络和蛋白质作用网络的下游,所提供的是生物学的终端信息。 如同我们在长江的上游建大坝或对江水改道,这些项目的生态影响会在下游的河道和地域体现出来一样,我们经常说,基因组学和蛋白组学告诉你可能发生什么,而代谢组学则告诉你已经发生了什么。
什么是代谢组学?代谢组学是用来解决什么问题的?代谢组学(Metabonomics/Metabolomics)是20世纪90年代末期发展起来的一门新兴学科,是研究关于生物体被扰动后(如基因的改变或环境变化后)其代谢产物(内源性代谢物质)种类、数量及其变化规律的科学。代谢组学着重研究的是生物整体、器官或组织的内源性代谢物质的代谢途径及其所受内在或者外在因素的影响及随时间变化的规律。代谢组学通过揭示内在和外在因素影响下代谢整体的变化轨迹来反映某种病理生理过程中所发生的一系列生物事件。代谢组学的研究对象与层次有哪些?一般来说,代谢组学关注的对象是分子量在1000以下的小分子化合物。根据研究的对象和目的不同,科学家将生物体系的代谢产物分析分为4个层次:代谢物靶标分析:某一个或几个特定组分的定性和定量分析,如某一类结构、性质相关的化合物(氨基酸、有机酸、顺二醇类)或者某一代谢途径的所有中间产物或多条代谢途径的标志性组分。代谢物指纹分析:同时对多个代谢物进行分析,不分离鉴定具体单一组分。代谢轮廓分析:限定条件下对生物体内特定组织内的代谢产物的快速定性和半定量分析。代谢组分析:对生物体或体内某一特定组织所包含的所有代谢物的定量分析,并研究该代谢物组在外界干预或病理生理条件下的动态变化规律。

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代谢组学可以检测的样品种类有哪些?代谢组学主要研究的是作为各种代谢路径的底物和产物的小分子代谢物(分子量<1000)。其样品主要是血浆或血清,尿液,唾液,以及细胞和组织的提取液。我们也和一些公司或单位(如烟草公司、茶叶公司、制酒公司、酸奶公司、医院等)合作,做过植物,真菌,微生物提取物,脑脊液,淋巴液,昆虫血淋巴,羊水,卵泡液,膝盖滑液,眼泪,精液,胎盘,粪便及肠道内容物提取液等。一般代谢组学能检测出多少物质?不同的质谱平台灵敏度及偏向性都不一样,而且不同平台之间具有互补性。一般来说GC/MS检测血清样品能准确定性的物质约200个左右,检测尿液样品定性的物质约200个左右,其他样品(如肝脏,粪便,肠道内容物)也在几百这个数量级。如果采用全二维GC/MS,物质的数量要更多,可达1千以上。LC/MS检测物质的数量要远比GC/MS多,但能准确定性和定量的不多,视不同的平台(TQ、QTOF等)能达到几十至2-3百个物质。

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应用于代谢组学中的技术概述1、如何获得有效、可靠的代谢组学数据选用高灵敏度和高选择性以及能够检测大多数代谢物的技术;在给定的生物样品中,能够提供高度可重复性且低成本。目前没有一种分析工具具备上述所有特征,但目前应用最广泛的代谢组学方法:核磁共振波谱(NMR)和质谱(MS)与气相色谱(GC)、液相色谱、(LC)或毛细管电泳(CE)联用。然而,这些分析平台都不能单独提供生物样品中整个代谢组的全面鉴定和量化,因为每种不同技术都有一系列优缺点。2、非靶向代谢谱分析核磁共振波谱(NMR)应用于代谢组学,采用的是非靶向的方法,关注的是整体全局的代谢情况。非靶向代谢谱分析目的:通常用于鉴定和相对量化代谢物,这些代谢物依据分类,具有不同的功能。这种方法通常与生物标记物的发现、诊断和与疾病病理生理学相关假说的产生有关。优点:不必事先知道给定生物样品的代谢物种类;缺点:只对代谢物进行半定量,没有适当注释下,就识别出显著的峰,使深层机理和生化的理解复杂化。代谢物注释是确定代谢物结构和功能的过程,代谢物识别能力的局限性一直是代谢物组学研究的主要障碍之一。 3、靶向代谢谱分析质谱(MS)常被用于靶向代谢组学研究,重点是精确定量和鉴定一组特定的已知代谢产物。靶向代谢谱分析的目的:确定并对感兴趣的代谢物进行绝对定量分析,这是通过光谱匹配到真实的参考化合物来实现的,该参考化合物通常作为同位素标记化合物加入或用作标准曲线生成的额外标准物。通常与食品或药物管理引起的特定代谢物和途径的变化相关,是药物开发和毒理学中的重要分析工具。缺点:代谢谱仅限于已知的标准代谢物,用这种方法不适合识别新代谢物。研究检测技术核磁共振波谱法(NMR) 质谱(MS) 液相色谱—质谱联用(LC-MS) 气相色谱-质谱联用(GC-MS) 毛细管电泳-质谱(CE-MS)1、核磁共振波谱(NMR)(1)核磁共振波谱的概述核磁共振波谱:通过测量振荡射频电磁场与沉浸在强外磁场中的原子核的相互作用来研究分子结构。有些原子核具有所谓的核自旋值,这使得这些原子核能够产生核磁矩,因为它们在外部磁场中的行为就像旋转的磁铁棒。这些原子核相对于外场可以有不同的方向,每个方向都与一个特定的能级有关。所以,当一个质子被放置在一个外部磁场中,质子的磁矩分裂产生两个能级:一个高能级和一个低能级。然而,在核磁共振实验中,涉及到许多原子核,在平衡状态下,一组自旋态将在高能和低能态之间产生足以产生净磁场的能量差。施加电磁能的短脉冲可以诱导能级之间的跃迁,这一过程有助于原子核吸收能量,随后能量被释放为离散量子,并在核磁共振谱中记录为峰值。每一个峰的位置是通过相对于添加的参比化合物(通常是3-三甲基硅基丙酸盐(TSP))的化学位移(ppm)来确定的。根据化学位移(在波谱中的位置)和峰值强度,可以确定相对水平和生化物质。此外,如果加入已知浓度的内标物,则可获得绝对浓度。 (2)1HNMR(氢谱)1HNMR谱具有很小的化学位移范围(通常为0-10ppm),由于生物化学物质的复杂行和混合程度,峰的分离程度不高,峰值严重重叠(如,蛋白质、脂质和低分子量代谢物),使得谱的比对成为一项艰巨任务。谱峰重叠问题的克服:二维(2D) 1H NMR谱增加了信号的离散度,阐明了信号的连接性,从而有助于代谢产物的结构解释和鉴定。常用的2DNMR:J-resolved核磁共振谱;扩散有序谱(DOSY);同核穿透相关法相关光谱(COSY);全相关谱(TOCSY);异核键相关法异核单量子相关光谱(HSQC);异核多平衡相关谱(HMQC);异核多键相关谱(HMBC);全空间相关法核超限效应谱(NOESY)。利用异核相关,例,1H与氮(15N)、碳(13C)或存在磷(31P)的情况下,提供了一种信息途径,但存在明显的局限性,即15N(0.37%)和13C(1.1%)的丰度较低,而且大多数代谢物不含31P。Ø因此,核磁共振波谱的一个固有问题是灵敏度相对较低。技术改进:超导低温探针(探测器冷却到接近绝对零温度)、增加磁场强度(目前为900MHz)和低体积微探针,继续提高核磁共振波谱的灵敏度。核磁共振波谱技术独特的优势:跨实验室的高度再现性;通常允许以无创或微创的方式收集样品,例如尿液、血液和精液;需要少量样品和最少或无样品制备;快速;无损。因此,随着时间的推移,有可能从同一个体中采集多个样本,从而绘制特定病理生理条件下发生的代谢变化图。作为一个独特的特征,这些样品随后可以重复用于进一步的分析,例如转录组学和蛋白质组学等。以上优势同样适用于高分辨率魔角旋转(HRMAS)核磁共振波谱(HRMASNMR)。HRMAS NMR:基本上是分析完整组织的唯一方法。在没有任何预处理的情况下,样品以54.7°的“魔角”相对于外加磁场快速旋转,这降低了完整组织的核磁共振谱线的展宽,因此与流体获得的分辨率相当。2、质谱(MS)(1)质谱法质谱法是通过测量电离分子在磁场中低压(真空)下的质量电荷比(质荷比:m/z)来研究分子结构的方法。质谱仪由三个基本组件组成:离子源、质谱分析仪和检测器。为了避免空气中分子的影响,真空是必不可少的。离子源使样品(气体、液体或固体)电离,产生分子离子和更小的碎片离子。这些离子通过质量分析仪加速,垂直磁场将根据其质量使离子偏转;较重的离子不会像较轻的离子那样偏转,从而允许质量分析仪根据其质量电荷比对离子进行排序,最终由检测器测量。输出以质谱表示,其中每个峰或条代表一个具有特定m/z(x轴)的离子,峰的长度代表相对丰度。 (2)物质的电离质谱的一个固有问题是只能分析气相中的离子,电离过程决定了可以区分的代谢物的类型和数量。没有一种单一的电离过程可以涵盖所有类型的代谢物。电离技术:电子电离(EI)和化学电离(CI),它们只能电离气相分子,电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解吸/电离(MALDI)适用于热不稳定和非挥发性分析物,如液体和固体。其他电离技术:快速原子轰击(FAB)、场解吸(FD)、激光电离(LIMS)和共振电离(RIMS)。基于MS的代谢组学的一个关键因素是,如果采用非靶向方法,则独立地应用不同的电离程序,以实现最大的代谢物覆盖率,反之,为靶向研究选择正确的电离方法。(3)质量分析器质量分析器根据离子的质荷比对其进行排序,并通过磁场或电场对其进行分类。 与电离过程一样,不同的分析仪类型也被开发出来,每种类型都有各自的优缺点。一些最常用的分析器是飞行时间(TOF)、四极质量滤波器、四极离子阱、傅里叶变换离子回旋共振和轨道捕获。(4) 检测器探测器,它测量通过离子的电荷。因此,在给定的代谢组学研究中,必须仔细选择质谱仪,以获得高灵敏度和高选择性,并进行准确的分子鉴定。准确的分子鉴定可以通过串联质谱来实现,串联质谱是一种能够进行多轮质谱的质谱仪,可以进行碎片研究和非常精确的质量测定。有时,质谱仪的一些更常见的配置变得普遍,形成复合缩写,如TIMS(热电离质谱)和MALDI-TOF(基质辅助激光解吸/电离和飞行时间)。(5)质谱法面临的问题尽管质谱技术不断进步,但由于可变电离和离子抑制效应影响分析物的精确定量,分析高度复杂样品时仍然存在一个固有问题。为了部分地弥补这些局限性,采用不同的技术来降低质谱前分析物的复杂性。最常用的技术是色谱和电泳。3、液相色谱—质谱联用(LC-MS)液相色谱法使用液体,通常是水和有机溶剂的混合物,在高压下工作,因此被称为高效液相色谱(HPLC)。在高效液相色谱过程中,给定的样品在高压下被液体强制通过色谱柱。柱本身包含一种固体吸附材料,根据其与吸附材料相互作用程度的不同,该材料将减慢化合物的通过,从而分离单个物质,提供不同的保留时间。通过改变色谱柱和液体,可以分离出不同种类的物质,然后引入质谱仪。最常用的高效液相色谱法是反相高效液相色谱法(RP-HPLC),但极性和离子性化合物很难用这种方法检测,这就是为什么亲水性相互作用液相色谱法(HILIC)已被开发用于带电代谢物的分析。近年来,超高性能LC(UHPLC)已经提高了峰值分辨率,提高了速度和灵敏度。4、气相色谱-质谱联用(GC-MS)气相色谱法是一种简单的色谱法,用于分离和分析挥发性成分。气相色谱仪基本上是一个柱,惰性气体(通常是氦)通过它在高温下吹气。一个给定的样品会因此蒸发,挥发性分子被推过色谱柱,在那里它们与色谱柱的涂层相互作用。每种化合物在通过色谱柱时与涂层发生不同的相互作用,导致不同的保留时间,从而在挥发性分子被引入质谱仪之前提供有效的分离。该方法的一个主要优点是可以设计柱分离感兴趣的特定分析物,但GC的一个限制和先决条件是分析物在高温下易挥发和稳定。代谢物的覆盖范围可以通过非挥发性分子的化学衍生来提高,但代价是在代谢物组学数据中引入另一个变量。然而,许多代谢物仍然不易挥发,因此不能用GC-MS定量。 5、毛细管电泳-质谱(CE-MS)毛细管电泳是代谢组学中一种相对较新但功能强大的分析工具,它能快速、高分辨率地分析核酸、氨基酸、羧酸和糖磷酸酯等带电的代谢物质。使用毛细管电泳,来自给定样品的带电分析物将通过电极间电场引发的毛细管迁移。带电分析物根据其电泳迁移率进行分离,这意味着如果两个带电分析物具有相同的尺寸,则具有较大电荷的分析物将移动得更快;或者如果两个分析物具有相同的电荷,则较小的分析物将由于较少的摩擦而移动得更快。到目前为止,CE-MS主要用于分子的研究,但在处理极性强、带电荷的代谢物时,CE通常是首选,出于对结果快速需求。 代谢组学数据的化学计量方法1、数据的预处理不同的分析平台产生了大量复杂的数据。 为了能够提取出任何有意义的信息,需要对原始数据进行降噪、基线校正、峰值对齐、分箱(binning)、标准化(归一化)和数据缩放等预处理。正确的代谢组学数据预处理是获得有效信息数据的前提。2、化学计量方法概述预处理后的数据可以进行化学计量学,这是统计方法在化学系统中的应用,目的是提取有意义的信息。它已经成为代谢组学的一个重要组成部分,因为核磁共振和质谱都产生高维数据结构,与变量(峰或代谢物)相比,观测(样品)相对较少,使得这类数据适合于多元统计分析。多元分析工具的目标是将数据集的复杂性或维数降低到一个更易于管理的二维或三维数。在代谢组学中,最广泛使用的技术是以无监督或有监督的方式提取潜在变量。3、PCA分析(主成分分析)主成分分析(PCA)是最实用的无监督方法,它通过提取主要的变异源,在不知道数据所属类别的情况下,降低了数据的复杂度。 PCA对于检测异常值和样本的内在聚类非常有用,内在聚类对于随后在分组样本中识别相似的生物特征非常有用。4、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和正交PLS-DA(O-PLS-DA)是常用的监督方法,能够发现两个矩阵之间的基本关系,一个X矩阵包含自变量(例如,光谱强度值)来自样本和包含因变量的Y矩阵(例如,类别、性别、治疗反应)PLS-DA和O-PLS-DA通常用于识别不同样本组之间的生物标记物和差异,例如健康组和患病组。使用PCA、PLS-DA和O-PLS-DA时,存在数据过度过滤的风险,因此必须进行严格的统计验证。

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