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文章题目：A Targetable EGFR-Dependent Tumor-Initiating Program in Breast Cancer
中文题目：乳腺癌EGFR靶向依赖的肿瘤启动程序
发表期刊：cell reports
发表时间：2017.10影响因子：8.032[图片上传失败...(image-2455af-1621337002656)]
前言
基底细胞样型乳腺癌(basal-like subtype breast cancer，BLBC)为高级别浸润性癌，ER-和(或)PR-、HER2-，又称三阴性乳腺癌(TNBC)。三阴性乳腺癌在多个层次上均存在异质性，因此不管是诊断还是治疗上均面临着比较大的挑战。尽管大约30％的TNBC对标准化学治疗药物敏感，从而提高生存率，但目前尚未有获批的针对化疗耐药患者的靶向治疗药物。表皮生长因子受体（EGFR）在部分TNBC高表达，但EGFR靶向疗法的临床受益率只有1.7％-38.7％，表明针对EGFR的疗法在乳腺癌中具有可变且不可预测的反应。作者构建了一批主要由TNBCs 构成的(15/18)的PDX模型，用这些模型来测试吉非替尼（EGFR抑制剂）的敏感程度，发现有1例PDX反应比较特殊（GCRC1735，来自一个70岁的老年女性），该例样本对药物治疗效果非常敏感。对来自这位特殊应答者的3500个细胞进行单细胞转录组测序，鉴定到显示出不同生物学特征的细胞亚群，其中EGFR高表达的细胞在间充质/干细胞样细胞亚群中显著富集。分选的EGFRhi细胞亚群表现出明显的肿瘤干细胞样细胞特征：高ALDH活性、球形成效率以及成瘤和转移潜能。EGFRhi细胞在原发性和转移性肿瘤中产生EGFRhi和EGFRlo细胞，表明EGFR依赖性的细胞扩增和分级状态转变。在独立的PDX中鉴定了类似的致瘤性EGFRhi亚群，其中EGFR表达与吉非替尼敏感性相关，这为TNBC患者中EGFR依赖性分级以及治疗干预提供了新的理解。
研究思路
文章结果
1. ****乳腺癌患者PDXs对EGFR抑制的响应模型筛选
为了探讨临床上乳腺癌EGFR抑制敏感性的功能机制，作者构建了一个主要由TNBC构成的PDX（patient-derived xenografts）（15/18）模型，采用PDX临床试验的方法，对EGFR抑制剂吉非替尼的敏感性进行队列筛选。以前有报道吉非替尼在TNBC病人里面有效率最高是38.7%，作者的实验结果与之相符(6/18，至少50%肿瘤生长率抑制)（下图A）。其中有1例反应比较特殊（GCRC1735），敏感性最高，并且在治疗7个月后显示出明显的肿瘤抑制，并且没有出现肿瘤生长反弹（下图B）。扩大验证获得相同的结果（n = 6 gefitinib, n = 7 vehicle）（下图C、D），吉非替尼处理两周后样本RGFR磷酸化（pEGFR）程度降低&pERK通路下调（下图E），凋亡通路激活（下图F、G）。
对特异反应PDX样本供体的原发肿瘤进行全面的组织学、转录组学和基因组分析，发现患者携带BRCA1突变（p.C1225Sfs）和TP53突变（p.R249T）（下图H、I）。未在EGFR中发现SNV或拷贝数改变（CNA），EGFR通路相关的基因也没有太大的异常（只有TSC2出现亚克隆，以及FGFR4和MAPK9部分扩增），因此EGFR及其信号通路成员的遗传改变不能解释对EGFR抑制的异常反应（下图J），值得探究。
2. ****群体单细胞转录组测序鉴定间充质/干细胞样亚群内的EGFR表达差异
常规方法无法确定吉非替尼对EGFR抑制的敏感性机制，免疫荧光检测发现在原发肿瘤和PDX的恶性细胞中，均观察到EGFR表达异质性（下图A）。为了准确的了解EGFR异质表达的功能相关性，作者对小鼠PDX模型的新鲜细胞利用10X单细胞测序技术单细胞转录组测序（3483个细胞，每个细胞平均表达40564个转录本和5146个基因）。对来自前五个组分的细胞基于t-SNE聚类分析的方法构建出六个亚群：间充质/干细胞样亚群、干细胞样亚群、核/线粒体亚群、增殖细胞亚群、抗原呈递亚群、基质细胞亚群，另外还鉴定了具有很少基因表达差异的过渡细胞亚群，其在t-SNE聚类图中呈现弥散状态，因此将其排除在分析之外（下图B）。不同细胞亚群表达不同的基因，且EGFR表达存在差异（下图C-F）。
结合公共乳腺癌数据库数据，发现和其他乳腺癌亚型相比，TNBC中间充质/干细胞样细胞亚群marker基因表达升高并伴随不良预后（下图G-I）。此外，新辅助化疗后间充质/干细胞在残留乳腺肿瘤中富集（下图J），表明EGFR高表达细胞亚群其转录特征与不良预后TNBC相关。
3. ****EGFRhi****间充质/干细胞亚群具有功能性富集肿瘤的潜力
为了进一步研究各个亚群之间的关系，拟时序（Monocle）分析发现，间充质/干细胞亚群分布于末端分支，与位于另一极端的基质细胞亚群&核/线粒体细胞亚群相对（下图A）。过度细胞亚群和抗原呈递细亚群分布广泛，增殖细胞亚群紧邻着核/线粒体亚群。间充质/干细胞亚群与正常乳腺干细胞特征之间存在显著重叠，间充质/干细胞Marker基因和EGFR在正常乳房的基质细胞（具有再生特性）中高表达（下图B），表明间充质/干细胞亚群的未分化性质。
为了鉴定EGFR是否在干细胞样/再生性细胞中高表达，使用流式分选EGFRhi和EGFRlo细胞亚群，和单细胞测序结果一致，充质质/干细胞亚群marker基因在EGFRhi细胞高表达（下图D）。为了证明EGFRhi细胞是具有更高的成瘤能力，作者分别开展了体内和体外验证试验。与EGFRlo亚群相比，在EGFRhi中ALDH活性增强、球形成效率（SFE）提高（下图E、F），两者都与肿瘤起始能力相关。两种细胞侧移植后，EGFRhi成瘤能力更强（下图G），且EGFRhi细胞形成的原发瘤中，重现了EGFRhi和EGFRlo细胞的异质表达模式（下图H）。未分选的细胞在小鼠体内移植成瘤后，肺部微转移病灶中出现了EGFRhi和EGFRlo细胞的重构（下图I）。为了检测这些细胞亚群是否反映不同的遗传亚克隆特性，在由EGFRhi细胞建立的不同肿瘤球中研究EGFR的表达。 发现EGFRhi细胞产生的所有球体表现EGFR表达异质性（下图J）。这些数据支持了肿瘤发展的分层模型，其中EGFRhi细胞显示出增强的致瘤性和转移能力，并且EGFRhi细胞在肿瘤体内产生EGFRlo细胞。
吉非替尼诱导的肿瘤消退后，显微观察发现残存着EGFR阳性，吉非替尼耐药细胞亚群，并且这些细胞持续处于非增殖性的EGFR抑制状态，但其保持了启动肿瘤发生的能力，吉非替尼戒断后或将这些细胞再移植给未处理的第二受体小鼠后，肿瘤快速再生长证明了这一点（下图K-P）。
为了理解持久性干细胞样群体的存活或增殖扩增是否需要EGFR活性，体外评估球形成，并在吉非替尼存在下体内评估肿瘤起始。吉非替尼治疗或从培养基中消除EGF并未减少SFE，表明EGFR激酶活性对于体外TIC（Tumor-initiating cells）存活不是必需的（下图Q-S）。尽管在吉非替尼存在下没有明显的肿瘤发生，但是在治疗停止时出现肿瘤生长，证明吉非替尼在体内不抑制TIC的存活，但是消除了TIC的增殖性生长（下图T）。这些数据共同支持EGFRhi TIC形成肿瘤干细胞的层次结构，其由不依赖于EGFR活性的自我更新的TIC以及高度依赖EGFR活性的EGFRhi肿瘤扩增细胞组成。
4. ****EGFRhi****异质性与TIC活性相关联
使用免疫荧光评估不同PDX队列中EGFR的表达，观察到EGFR表达的不同模式，在GCRC1735中发现EGFR表达异质性，但在其他样本(GCRC1915)发现表达均一性（下图A-C）。免疫荧光检测的EGFR的平均表达强度与肿瘤免疫印迹定量显著相关（下图D）。在PDX组中，EGFR异质性与对吉非替尼的敏感性增加相关（下图E）。
EGFR高表达、高异质性样本(HCI001)和EGFR高表达、低异质性样本(GCRC1915) 被选择来检查TIC EGFR依赖性。HCI001中观察到在响应吉非替尼时，肿瘤生长受抑制，表现出显著延长的无终点存活， GCRC1915中未观察到对生长抑制或终点存活的影响（下图F、G）。EGFR在两种肿瘤模型中均被磷酸化，并且在治疗后48小时观察到EGFR抑制，证明肿瘤样品中EGFR磷酸化的药效学评估不足以预测药物响应（下图H）。
为了研究肿瘤起始能力是否依赖于EGFRhi群体，作者在体内评估了流式分选的EGFRhi和EGFRlo亚群成瘤能力。 EGFRhi亚群在吉非替尼敏感模型（HCI001）中显示肿瘤生长加快，而在吉非替尼不敏感的肿瘤GCRC1915中，EGFRhi和EGFRlo亚群之间的致瘤能力没有差异（下图I）。 值得注意的是，源自HCI001的EGFRhi亚群的肿瘤中出现了在未分选的肿瘤中观察到的EGFRhi和EGFRlo表达的多样性（下图J）。
总之，本文鉴定了人乳腺癌的一个亚型，其EGFR表达异质性与TIC活性和肿瘤扩展相关，从而使这些肿瘤对EGFR抑制敏感。
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