2019汇总之从4个关键词看单细胞与肝癌文献

• 文献汇总 | 2019的单细胞与病毒感染

在讲单细胞与肝癌之前，我们先去看一下单细胞揭示正常肝脏细胞特征的分析，该文章于2019年7月发表于***Nature***，研究团队对来自9位人类供体的正常肝脏组织中的大约10,000个细胞进行了单细胞RNA测序，以构建人类肝脏细胞图集。

研究内容：

研究人员使用mCEL-Seq2进行了9例未患病肝脏组织的scRNA-seq。所创建的细胞图谱涵盖了所有重要的肝脏细胞类型，包括肝细胞、肝脏主要代谢细胞、血管内皮细胞、肝脏巨噬细胞以及其他免疫细胞类型。

利用单细胞RNA测序技术，研究人员发现：

• 同类细胞异质性较大。 同一细胞类型的个体细胞之间存在惊人的多样性，并揭示了此前从未被描述的肝细胞、内皮细胞和Kupffer细胞的新亚型。尽管这些细胞虽然在形态学上没有什么不同，但具有离散的基因表达谱。在揭示B细胞时，作者发现，MS4A1+CD37+的B细胞亚型上调MHCII类相关基因，并被定义为循环B细胞。

• 双能上皮祖细胞揭示胆管细胞的发育轨迹。 研究人员还发现了胆管细胞亚群的一些此前未知的特性，并对其发育轨迹进行了详尽的描述。

• 肝癌中存在扰动的细胞状态。 作者对三名患者的HCC组织中的CD45 +和CD45–细胞进行了测序，从肿瘤中发现了多种细胞类型，包括癌细胞，内皮细胞，库普弗细胞。

  将NKT细胞和NK细胞与正常肝细胞图谱进行比较，差异基因表达分析和免疫组化发现，癌细胞失去了细胞色素P450基因（如CYP2E1和CYP2C8）和肝周围区带状基因CPS1的表达，以及正常肝细胞的代谢信号。他们显示出AKR1B10的表达增加，AKR1B10是HCC的已知生物标志物，可能参与肝细胞癌变。此外，免疫组织化学证实IL32（一种促炎性TNFα诱导细胞因子）在癌细胞中高度上调。

  总体而言，癌细胞显示出WNT和Hedgehog信号通路的上调，突显了EPCAM +正常肝祖细胞与观察到的癌细胞群之间的相似性。

意义：该图谱为肝脏疾病的研究提供了重要参考，将有助于开发急需的人类肝脏模型，包括类器官和人源化肝脏嵌合体小鼠模型。作者还强调，这样的细胞图谱可能不仅对理解正常的肝脏生物学有帮助，而且对理解肝癌和其他形式的肝脏疾病尤为重要。

关键词：肝癌炎症状态和细胞间的互作关系

2019年10月31日，北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）、生命科学学院、北京未来基因诊断高精尖创新中心（ICG）张泽民课题组联合首都医科大学附属北京世纪坛医院彭吉润课题组以及德国药企勃林格殷格翰公司多位科学家，在国际期刊***Cell***发表了题为Landscape and Dynamics of Single Immune Cells in Hepatocellular Carcinoma的研究论文。

研究团队结合10x Genomics和SMART-seq2两种单细胞RNA测序技术，对肝癌患者多个组织的免疫细胞做出了系统性的刻画，分析了免疫细胞动态迁移和状态转化的特征，探索了它们在肝癌治疗上的潜在价值。 （Hemberg-lab单细胞转录组数据分析（七）-导入10X和SmartSeq2数据Tabula Muris）

本研究收集肝癌病人的癌组织、癌旁组织、淋巴结、外周血和腹水五种组织的CD45+免疫细胞进行实验，并分析肝癌免疫微环境中的细胞类型、表达特征，以及不同组织之间细胞的动态变化与联系。

研究内容：

• 腹水中的淋巴系和髓系细胞可能具有不同的来源。 作者通过对以上组织进行单细胞转录组测序，发现不同组织的免疫组成有较大差异，肿瘤中的巨噬细胞构成腹水中髓系细胞的主要来源 ，而淋巴细胞主要来自于血。

• 研究者发现肝癌肿瘤中的巨噬细胞呈现两种不同的状态 ：TAM-like和MDSC-like状态。生存分析表明，前者的特征基因与预后不良有关，其表达的两个关键基因SLC40A1和GPNMB也与预后不良有关。

• 肿瘤中的LAMP3+ DC是成熟态的DC，具有向肝淋巴结迁移和与多种淋巴细胞相互作用的潜在能力 。

• 通过前沿的生物信息学分析方法RNA velocity和基于线粒体突变的进化树构建，研究者发现LAMP3+ DC可能同时起源于cDC1和cDC2，且具有向肝淋巴结迁移的潜在能力。

意义：本项研究首次对肝癌临床样本进行包括病理组织在内的多组织位点的收集，并利用前沿的生物信息学分析方法，通过自体对照，不仅描述了肝癌微环境的免疫组分和状态，而且描绘了肿瘤浸润免疫细胞跨组织的动态过程。

关键词：瘤内异质性，微环境及预后

2019年10月美国国家癌症研究所癌症研究中心在期刊***Cancer Cell***上发表题为Tumor Cell Biodiversity Drives Microenvironmental Reprogramming in Liver Cancer的研究论文。

作者通过对肝细胞癌（HCC）和肝内导管癌（iCCA）患者的癌症样本进行单细胞测序，揭示瘤内异质性（ITH）与患者用药的预后关系，阐述肿瘤微环境及免疫细胞极化条件下对肿瘤细胞的影响。

研究内容：

作者首先对HCC和iCCA的肿瘤样本进行单细胞测序,发现与之前表达一致，肿瘤细胞形成patient-specific clusters(就是每个患者的肿瘤细胞均为单独聚类)，其他的非肿瘤细胞则可以根据细胞类型进行聚类，如T，B，CAFs和TAM等（Hemberg-lab单细胞转录组数据分析（十二）- Scater单细胞表达谱tSNE可视化）。

• 瘤内异质性与患者预后高度相关：为了确认瘤内异质性（ITH）的程度，作者发明了tumor cell-specific transcriptomic diversity scores去评估ITH，并将8个肿瘤样本分为高变组（Div-high）和低变组（Div-low）。作者发现与高变组相比，低变组肿瘤患者的预后更好。为了证实以上的观点，作者分别使用ICGC（https://icgc.org）上的队列数据（bulk transcriptome）进行生存分析，发现与单细胞数据观点相同。

• VEGF在癌细胞中的表达与TME重编程相关：由于在高变组和低变组的非肿瘤细胞也发现有一定的不同，作者认为可能是高变组的肿瘤细胞通过细胞因子诱导肿瘤微环境（TME）进行重编程。作者在高变和低变组中的top差异基因为VEGFA（vascular endothelial growth factor A），尤其是在CAF(cancer-associated fibroblasts)，TAM(tumor-associated macrophages)和TEC( tumor-associated endothelial cells)中。并发现VEGF可以调节缺氧相关基因并导致TME极化。

• 低变组肿瘤细胞相关的T细胞表现出细胞溶解活性：作者发现T细胞毒性相关基因（如GZMA,GZMB,GZMH,PRF1）等均在低变组高表达，而免疫检查点分析（如PDCD1,IFNG,NKG7）等也在低变组高表达。结果表明，HCC和iCCA中的T细胞景观十分复杂，并且某些T细胞亚群与患者的预后密切相关。其结果还表明，T细胞在Div-High和Div-Low肿瘤中的作用不同，这可能是肿瘤免疫监视状态的指标。

意义：单细胞分析提供了一种可行的策略，可在单细胞水平上了解ITH的动态，这可能有助于了解肿瘤生态系统内的行为和调控机制。

关键词：多组学揭示肿瘤异质性及免疫表型分型

2019年6月由浙江大学医学院附属第一医院肝胆胰外科团队在***Hepatology***上发表题为Integrated multiomic analysis reveals comprehensive  tumour heterogeneity and novel immunophenotypic  classification in hepatocellular carcinomas的研究内容，通过全外显子组测序，RNA测序，基于质谱的蛋白质组学和代谢组学，cyTOF和单细胞分析，对肿瘤的异质性进行评价，对免疫微环境进行分析。

研究内容：

• 蛋白质组学分析和拷贝数改变。在所有样品中，作者总共检测到11266个DNA上的非同义单核苷酸变异（SNV），RNA水平上的14706个非同义SNV和蛋白质水平上的1875个单氨基酸变异。通过比较MS/MS谱图和由WES突变数据转化的蛋白质数据库，分析了突变蛋白质。基因组中检测到的仅20.8％的体细胞突变在转录组中表达。基因组和转录组中已确认的蛋白质水平变异体的数量也很少（9.32％）。

• HCC患者肿瘤异质性的不同维度：作者使用基因组，转录组学，蛋白质组学，代谢组学和免疫学分析描述了病灶内，病灶间/肿瘤内和肿瘤间/患者间的异质性。在基因组维度上，同一肿瘤中不同病灶的突变谱不同，但病灶间/瘤内异质性程度小于瘤间异质性。

• PI3K-Akt信号通路和酮体代谢与抗肿瘤免疫相关：为了了解肿瘤异质性背后的潜在机制，并发现肿瘤细胞与局部免疫之间的潜在关系，作者开发了一种富集方法，并使用基因组，转录组学和代谢组学数据生成了整合图。两条KEGG通路（即PI3K-Akt信号通路，酮体的合成和降解）与HCC微环境中肿瘤浸润性T细胞的丰度紧密相关。PI3K-Akt信号通路富集得分高与T细胞浸润增加有关。总体而言，参与此途径的大多数蛋白质（来自蛋白质组学数据）的表达水平与T cell丰度呈负相关且显着相关。这些数据为肿瘤异质性提供了分子见解，并提出了新颖的机制，肿瘤细胞通过这种机制来影响HCC的抗肿瘤免疫力。

• 新型免疫表型分类的基本原理：作者首先探讨了这三种HCC亚型之间的代谢组学差异。HCC亚型3表现出抑制的糖酵解作用和增强的线粒体呼吸作用，这归因于降低的乳酸水平和增加的涉及三羧酸（TCA）循环的代谢产物丰度。HCC亚型2显示增加的核苷酸生物合成活性，而亚型1的特征是通过尿素循环上调所引起。介导这些代谢过程的酶表达水平的改变与代谢物水平的改变是一致的。最后作者使用qPCR验证其免疫表型分类的有效性。

意义：在HCC的各个方面都存在全面的肿瘤内和肿瘤间异质性。基于结果，作者提出了一种新型的HCC免疫表型分类法，该分类法有助于预后预测，并可能支持有关治疗选择的决策。

Reference

• https://www.nature.com/articles/s41586-019-1373-2

• https://www.cell.com/cell/pdf/S0092-8674(19)31119-5.pdf

• https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1535610819303757

• https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6839802/