what is bam
bam（或者是sam，cram）文件，是比对后拿到的文件，sam文件是纯文本，非常占用存储空间，bam是sam的二进制格式，cram则是进一步压缩后的格式，这三者所记录的内容是一致的，但是bam文件是最常用的。记录了每一条reads比对到参考基因组的结果，主要有11列比较重要的信息（每一列以制表符分开）：
更多的说明可以查看官方教程：
https://samtools.github.io/hts-specs/SAMv1.pdf
取小bam
由于原bam文件特别大，下载到本地载入igv非常耗资源，所以我们就提取一个小的bam进行演示。首先，要构建索引，提取小bam，这里我们提取17号染色体的信息：chr17。再对小bam文件构建索引，因为igv要求bam文件需要带索引才能载入。
以case1_biorep_A_techrep.bam为例
我的所有的bam文件
case1_biorep_A_techrep_WES.bam case4_techrep_2_WES.bam
case1_biorep_B_WES.bam case5_biorep_A_WES.bam
case1_biorep_C_WES.bam case5_biorep_B_techrep_WES.bam
case1_germline_WES.bam case5_biorep_C_WES.bam
case1_techrep_2_WES.bam case5_germline_WES.bam
case2_biorep_A_WES.bam case5_germline_WES.sam
case2_biorep_B_techrep_WES.bam case5_techrep_2_WES.bam
case2_biorep_C_WES.bam case6_biorep_A_techrep_WES.bam
case2_germline_WES.bam case6_biorep_B_WES.bam
case2_techrep_2_WES.bam case6_biorep_C_WES.bam
case3_biorep_A_WES.bam case6_germline_WES.bam
case3_biorep_B_WES.bam case6_techrep_2_WES.bam
case3_biorep_C_techrep_WES.bam CCDS.current.txt
case3_germline_WES.bam hg38.exon2.bed
case3_techrep_2_WES.bam hg38.exon.bed
case4_biorep_A_WES.bam nohup.out
case4_biorep_B_techrep_WES.bam qualimap/
case4_biorep_C_WES.bam stat/
case4_germline_WES.bam
(wes) 09:42:42 [email protected]:/data1/jiarongf/learning/cancer-WES/4.align
$
samtools index case1_biorep_A_techrep_WES.bam
(wes) 09:50:55 [email protected]:/data1/jiarongf/learning/cancer-WES/4.align
$
samtools view -h case1_biorep_A_techrep_WES.bam 17 | samtools view -Sb - > small.bam
(wes) 09:56:40 [email protected]:/data1/jiarongf/learning/cancer-WES/4.align
$
samtools index small.bam
(wes) 09:57:31 [email protected]:/data1/jiarongf/learning/cancer-WES/4.align
$
天，一个就跑了八分钟，感觉要很久，小的那个bam好像还行
对比一下大小，如果还觉得太大，上面提取的参数chr17可以改为类似chr17:42850000-42950000。
载入IGV
http://software.broadinstitute.org/software/igv/download
IGV下载官网
然后把小bam文件及其索引下载到本地，打开IGV，加载hg38参考基因组，然后把bam文件拖到IGV窗口中。
导进去的话直接拖进去就好了，默认IGV的参考基因组是人19的，我们要选择hg38的，所以搜一下就行，这里还有GATK专用的基因组，这用的是hg38的，导进去会发现不显示序列reads是因为IGV默认30bp以下的才会显示，所以直接选择17号染色体以后直接点+，一致到bp小于30，就和上述的一样的了。
定位到感兴趣的位置
也可以在搜索框中输入感兴趣的位置或者基因，比如chr17:42,850,644-42,853,784或者AOC3
可以看到在该基因的区域，有多少reads覆盖了，
Coverage即覆盖深度，可以直观的看出染色体的每一处reads的覆盖情况，因为我们是外显子捕获测序，所以极大部分的reads都覆盖到了参考基因组的外显子区域及其侧翼区域。值得注意的是在这一行开头有峰的高度范围，且默认是随覆盖深度动态变化的。
这个下面其实还有一行是Junctions，一般用于转录组数据，可以看可变剪切，默认是不显示的。
bam文件中reads详细信息，每一块代表一条reads，将鼠标放到某一条reads上，就会呈现该reads的详细比对信息，与bam文件的中信息相对应。而且可以通过鼠标右键，调出设置菜单，方便进一步探索。
sequence，参考基因组的序列碱基信息，当放大至一定程度时就会显示出来。
参考基因组注释信息，可以看到有基因、外显子、内含子、5'UTR、3'UTR等，还可以右键选择显示基因的各个转录本。
颜色代表的含义
可以看到，这些reads大多数是灰色的，部分是透明，少部分是红色、蓝色、棕色等等，不同的颜色有不同的含义。
灰色：指的是比对成功，没有其他特别的含义
白色：指的是比对失败，对应的是bam文件中第5列，MAPQ比对质量值，我们把鼠标放到透明的reads上就可以看到
红色和蓝色：igv会根据配对的两条reads的距离，即bam的第9列TLEN，可以理解为测序时文库插入片段长度，来判断是否存在染色体的结构变异deletions,insertions,inter-chromosomal rearrangements。红色代表插入片段大于期望值，可能是deletions的证据，蓝色代表插入片段小于预期，可能是insertions的证据。我们可以通过右键选择view as pairs来进一步理解这个含义。蓝色的两条reads重叠，而红色的reads距离都比较大
其他颜色：指的是这条reads所配对的另一条reads没有比对到同一条染色体，不同颜色代表不同染色体，具体看下图：
比如下面棕色的reads，代表与之配对的reads比对到了11号染色体上了：
我们可以通过bam文件来检验一下，因为是pair-end，所以id号相同，可以grep 89335031：
$ samtools view -h case1_biorep_A_techrep.bam chr11 | grep 89335031
case1_biorep_A_techrep.89335031 65 chr11 96427099 60 76M chr17 42852401 0 AAATTGAATCTGCAATTTCTCAACCCATTAAATTGTTCATCAATGCTGAACTAATACAAGAGTTACATTAATAAGC @>>??G?@AEDEDCAAAADCECADBBCAAABA?@FAAECAEBA@EEDCAADDABAADCBEAF@A@EC@@=A@>@DD NM:i:0 MD:Z:76 MC:Z:76M AS:i:76 XS:i:19 RG:Z:case1_biorep_A_techrep
$ samtools view -h case1_biorep_A_techrep.bam chr17 | grep 89335031
case1_biorep_A_techrep.89335031 129 chr17 42852401 60 76M chr11 96427099 0 GCTTCCAAGGAGAAAGACTAGTTTATGAGATAAGCCTCCAAGAGGCCTTGGCCATCTATGGTGGAAATTCCCCAGC @@@?DDCAFCAEABAE@DC@E@@@@ADAFAAAAEEBCDCBAFAFDECDAFDEDBAEDBBFD@GD@AAA@E@CA@DD NM:i:0 MD:Z:76 MC:Z:76M AS:i:76 XS:i:0 RG:Z:case1_biorep_A_techrep
关于颜色更多的介绍，请参考igv官方文档：
http://software.broadinstitute.org/software/igv/interpreting_insert_size
文章还有这一部分，我就不做了，应该是对的，搜寻的未知是点开的小窗口中的第一行read name的那个数字
不同组学的测序策略不同，这里展示的是外显子组的bam文件，还有其他组学的bam文件也可以在igv中可视化，对此推荐大家看一下不同组学测序数据拿到的bam文件在igv可视化结果的区别：各种NGS组学数据分析异同点视频讲解
介绍到这里只讲了一部分，还有bam文件载入igv也可以看变异位点，SNP和INDEL，这部分我们留到后面分析拿到vcf文件后再继续讨论。
下一期我们将走gatk最佳实践流程，并且会详细介绍每一步分析的原理以及需要注意的细节。
上面也是一些教程的内容，在此进行记录