2020-10-15 入门小组DAY7-三三

测序知识

学习内容

• 怎么区分一二三代测序
• 二代测序大体流程
• NGS组学都包括哪些分类（粗略）

本篇笔记内容整理来自测序的世界/by刘小泽以及微信公众号生信星球的推文

测序过程和原理

简单来说，测序技术就是将DNA/RNA分子中碱基ATGC的排列顺序显示出来。

• 一代测序（Sanger测序，又称为SBS法、末端终止法）

1. 核心原理
   由于双脱氧核苷酸(ddNTP)的3’位置脱氧，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影，根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。

2. 优缺点
   准确性好，但通量小、成本高。
   目前一代测序在验证序列（就是平时送公司测序返回来自己blast的那些）以及验证基因组组装完整性方面都是金标准。

   
   
   Sanger测序原理/图源水印

Sanger测序原理/图源刘小泽

Sanger测序/图源生信星球.jpg

• 二代测序（NGS ，循环阵列合成测序法）
  以Illumina平台为代表的第二代测序技术实现了高通量测序，有了革命性进展，使得大规模并行测序成为现实，极大推动了生命科学领域基因组学的发展。
  优缺点：二代测序大幅度提高了测序速度，降低了测序成本，保持了高准确性。缺点是读长短，拼接困难，pcr技术增加了测序的错误率。
  Illumina循环SBS法(cycle SBS)即SBRT(Sequencing By Reversible Termination,可逆终止)的核心技术是DNA合成的可逆性末端循环，即3'-OH可逆性的修饰和去修饰。
  Illumina市场规模占到75%以上，主打Hiseq，下面主要介绍他的PE（Pair End双端）测序原理。

相关名词释义：
flowcell： 测序反应的载体/容器，1个flowcell有8个lane
lane： 测序反应的平行泳道，试剂添加、洗脱等过程的发生位置
tile： 每次荧光扫描的位置，肉眼是看不到的
双端测序： 可能序列比较长有四五百bp，两边各测120-150bp
junction： 双端测序中间一些没有测到的区域
flowcell构造：一个lane包含两列（swath），每一列有60个tile，每个tile会种下不同的cluster，每个tile在一次循环中会拍照4次（每个碱基一次）

1. 边合成边测序（sequence by synthesis, SBS）——合成

SBS/图源生信星球

①第一步：构建DNA文库
超声波将DNA分子打断成300-800bp长序列片段（人类基因组打成300-500bp），用酶补平为平末端，然后3‘端加一个A碱基（因为接头的3‘端有一个突出的T），再在两端加上互补配对的adapter，再通过PCR扩增达到一定浓度，构成单链DNA文库。
接头设计有两个作用：1. 实现桥式扩增，高效；2. 可以实现双端测序

添加接头

另外，利用低循环扩增技术在接头处进行修饰（加上一些周边）。

接头修饰

②第二步： 上样
重点搞清楚lane上有哪两种接头以及待测序列含有哪两种接头。
构建的DNA文库中的待测序列事先配置好一定的浓度，在通过flowcell(吸附流动DNA片段的槽道)时会随机附着在flowcell表面的lane上。每个flowcell有8个lane，每个lane的表面都附有很多接头短序列，这些接头能和建库过程中加在DNA片段两端的接头相互配对从而吸附住冲过来的DNA，并能支持DNA在其表面进行桥式PCR的扩增。

⚠️这里有三点要注意：
a. lane与lane之间一般不会相互影响，也就是说一般不会出现lane1固定的DNA又与lane2结合。
b. 待测序列自带了p5接头和p7接头；lane上随机分布两种接头，P5'（与P5互补），P7（与P7'互补）。
c. 序列只能一开始是利用P5接头互补（因为p7接头和lane是一样的）。

③第三步：桥式PCR
a. 第一轮
扩增模版：flowcell表面固定的序列 --> 模版链
第一轮结果：序列补成双链。

一个很重要的概念：我们要测序的是模版链p5 - p7，开始它与lane接头配对产生了互补链，后来强碱试剂作用下两条链被分开，由于模版链没有附着在lane上，模版链被冲走，但是互补链依然稳稳固定在lane上。接下来就要对互补链p5'- p7' 进行操作。

扩增模板

b. 去杂
加入NaOH强碱性溶液使双链DNA变性，互补链由于和lane上短序列强力连接固定住了；模板链失去了双链氢键连接，好似悬空，它会被洗脱。

c. 桥式形成
加入缓冲溶液，互补链的p7'和lane上的p7互补（但还是一个lane中的）就像下图这样（摘自illumina官网）。目的是快速扩增lane p7接头连接的链，也就是下图中的Forward Strand，它和我们的模版链是一致的。我们后来测序只用这一半。

桥式形成

d. 桥式PCR
PCR弯成桥状，一轮桥式扩增一倍。

e. 循环
大约35个循环后，最终每个DNA片段都将在各自的位置上集中成束，称为cluster，这是一群完全相同的序列。目的在于实现放大单一碱基的信号强度，满足后期测序需求。

f. 解链
桥式PCR完成后，形成了很多的桥形的互补双链，再次强碱解链。
这一次不再进行复制，而是利用一种酶——甲酰胺基嘧啶糖苷酶（Fpg）选择性的切掉lane上p5'连接的链，只留下了与lane p7连接的链即Forward Strand。

图源微信公众号IVD咨询

④第四步：测序
如何确定上面形成的cluster的碱基排序顺序呢？illumina采取了“一次加一个荧光碱基，用完失效”的办法。illumina的测序就是在Sanger基础上加上了桥式PCR，能克服Sange低通量的缺点。
官网给出的解释如下图：

测序

2. 边合成边测序（sequence by synthesis, SBS）——测序
a. 一轮测序：双端测序之Forward Strand
先是primer结合到靠近p5的sequencing primer binding site1上，再加入特殊的dNTP【它的3‘ 羟基被叠氮基团替代，因此每次只能添加一个dNTP；还含有荧光基团，能激发不同颜色】；在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉；再加入激发荧光缓冲液，用激光激发荧光信号，光学设备记录荧光信号的记录，计算机将光学信号转化为测序碱基。这一个循环就能测定flowcell上成千上万的cluster，这就实现了高通量。
b. 再向下一轮：
再加入化学试剂淬灭荧光信号并使dNTP 3’ 叠氮基团变成羟基，这样能继续向下进行再加一个，并且保证这个不再发出荧光。如此重复直至所有链的碱基序列被检测出。得到了Forward Strand序列。
因为一个cluster的序列是一样的，所以理论上cluster的荧光颜色应该一致。
c. Index测序：
上面的循环结束后，read product被冲掉，index1 primer和链上的index1 互补配对，进行index1的检测。测完后，洗脱产物，得到index1 的序列。接下来p5与lane上的p5‘配对，测得了index2，并洗脱。

index测序

d. 双端测序之Reverse Strand：
洗脱掉index2 产物后，还是一个桥式扩增，得到双链，再变性得到原始Forward strand 和 新的Reverse Strand， 除去测完的Forward strand。然后和测Forward一样，也是先连接primer，只是连接的位点是Primer Binding Site2，测完后得到reverse strand序列。

• 三代测序
  DNA测序时，不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序，凭借超长的读长和可直接检测表观修饰等特点使其成为市场的新宠。目前以Pacific Biosciences公司的SMRT技术和Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔单分子技术为主流。

名词结构化

• 基因组学（核酸序列分析）
  （1）全基因组测序（WGS）
  （2）全外显子组测序（WES）
  （3）简化基因组测序（RRGS）：①RAD-Seq；②GBS；③2bRAD；④ddGBS（也就是ddRAD）
  作用：
  （1）基因组作图（遗传图谱、物理图谱、转录本图谱）
  （2）核苷酸序列分析
  （3）基因定位
  （4）基因功能分析
  其它：
  以全基因组测序为目标的结构基因组学
  以基因功能鉴定为目标的功能基因组学

• 转录组学（基因表达分析）
  （1）mRNA-Seq
  （2）IncRNA-Seq（长链非编码RNA）
  （3）sRNA-Seq（主要是miRNA-Seq）

  
  
  small RNA.jpg

作用：
（1）获得物种或者组织的转录本信息
（2）得到转录本上基因的相关信息，如基因结构功能等
（3）发现新的基因
（4）基因结构优化
（5）发现可变剪切
（6）发现基因融合
（7）基因表达差异分析

• 蛋白质组学
  （1）蛋白质组数据处理、蛋白及其修饰鉴定
  （2）构建蛋白质数据库、相关软件的开发和应用
  （3）蛋白质结构功能预测
  （4）蛋白质连锁图

• 代谢组学
  （1）代谢物指纹分析
  （2）代谢轮廓分析

思维导图及网站收藏

测序技术

测序技术.png

收藏：
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（讲Illumina测序原理的）