测序原理碎碎念

大家都知道高通量测序，那你知道测序的接头是如何加上去的吗？

加接头的示意图

如上图所示大致步骤如下：

用酶或者激光或者超声波将Genomic DNA或者由RNA反转组得到的双链cDNA打断成小片段；

打断是随机打断，有可能末端不平整，还需要用酶补平；

补平之后，需要在3’端加A碱基；

加上A之后，再加adapter。

接头图解

涉及的基本概念

1、adapter

接头，为一段已知的短核苷酸序列，用于链接未知的目标测序片段

2、index或barcode

几个碱基组成的寡核苷酸链，用于在混合测序时，区分不同样本

3、insert

待测序的目标序列，位于两个adapter之间

测序片段示意图

测序片段包括几个部分：universal_adapter-insert-indexed_adapter

测序由5'端开始，最开始的几个碱基无法测得，第一个adapter在数据输出时去除，由于测序读长的限制，第二个adapter通常测不到。

但是如果插入片段本身较短，测序会测穿，即会得到 insert-部分adapter 这样的read，这里的adapter便是我们常常提到的需要去除的接头部分。

序列信息

1、接头序列（示例）

universal adapter:

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’

indexed adapter:

5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC(barcode)ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’

仔细看上面这对接头序列，universal adapter的3'末端的T与待测片段新增的A配对，那么剩余序列的反向互补链为

GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT

与 indexed adapter 的前面12个碱基一致

GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC，即两段接头序列部分互补，形成Y型的结构。

2、index序列

可根据fastq序列中的信息获取

@HWI-ST1276:71:C1162ACXX:1:1101:1208:2458 1:N:0:CGATGT

fastq的格式信息不再赘述，第一行最末的 CGATGT 即本次测序所使用的index。

测序原理解读视频