单细胞之富集分析-1：单细胞GSEA分析流程

单细胞GSEA分析需要的文件有两个：
1. 单细胞基因表达变化数据（两列，一列是geneid/gene symbol，一列是logFC）（文件格式：.rnk）
2. 目标基因集（文件格式：.gmx或.gmt）一行是一个term/基因集，第一列是基因集的名称，后面是基因分类等，再后面是geneid/gene symbol（要和单细胞矩阵的对应，否则不能识别）

1. 单细胞基因表达变化数据的准备

• 1.1 下载单细胞数据（pbmc5k）

wget http://cf.10xgenomics.com/samples/cell-exp/3.0.2/5k_pbmc_v3/5k_pbmc_v3_filtered_feature_bc_matrix.tar.gz
tar xvzf 5k_pbmc_v3_filtered_feature_bc_matrix.tar.gz

• 1.2 参考Seurat标准流程对数据进行预处理得到分群

library(tidyverse)
library(Seurat)
# Load the PBMC dataset
pbmc.data <- Read10X(data.dir = "filtered_feature_bc_matrix/")
# Initialize the Seurat object with the raw (non-normalized data).
pbmc <- CreateSeuratObject(counts = pbmc.data, project = "pbmc5k", min.cells = 3, min.features = 200)
#质控
pbmc[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = "^MT-")
#取子集
pbmc <- subset(pbmc, subset = nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 5000 & percent.mt < 25)
#标准化和归一化
pbmc <- NormalizeData(pbmc, normalization.method = "LogNormalize", scale.factor = 10000)
pbmc <- FindVariableFeatures(pbmc, selection.method = "vst", nfeatures = 2000)
all.genes <- rownames(pbmc)
pbmc <- ScaleData(pbmc, vars.to.regress = "percent.mt")
#PCA
pbmc <- RunPCA(pbmc, features = VariableFeatures(object = pbmc), verbose = FALSE)
#聚类
pbmc <- FindNeighbors(pbmc, dims = 1:20)
pbmc <- FindClusters(pbmc, resolution = 0.5)
#TSNE和UMAP降维
pbmc <- RunUMAP(pbmc, dims = 1:20)
pbmc<- RunTSNE(pbmc, dims = 1:20)
DimPlot(pbmc, reduction = "umap", label = TRUE)
#查找marker基因
pbmc.markers <- FindAllMarkers(pbmc, only.pos = TRUE, min.pct = 0.25, logfc.threshold = 0.25)
saveRDS(pbmc, "pbmc_5k_v3.rds")

分为13个亚群

• 1.3 使用wilcoxauc()计算每个cluster的差异基因

pbmc<- readRDS("pbmc_5k_v3.rds")
library(presto)
pbmc.genes <- wilcoxauc(pbmc, 'seurat_clusters')
head(pbmc.genes)
#     feature group     avgExpr         logFC statistic       auc
# 1 AL627309.1     0 0.004801016 -0.0048337160   2113594 0.4966881
# 2 AL627309.3     0 0.000000000 -0.0004923881   2126401 0.4996978
# 3 AL669831.5     0 0.058225088 -0.0101451241   2081447 0.4891337
# 4     FAM87B     0 0.000000000 -0.0017590952   2121900 0.4986401
# 5  LINC00115     0 0.033568380 -0.0054911605   2090280 0.4912094
# 6     FAM41C     0 0.015927696 -0.0162813395   2077756 0.4882664
#          pval         padj    pct_in    pct_out
# 1 0.0451711892 0.0817186691 0.5443235 1.20882442
# 2 0.3781096732 0.4754137751 0.0000000 0.06044122
# 3 0.0182067030 0.0364774662 6.8429238 9.21728619
# 4 0.0612494406 0.1063124181 0.0000000 0.27198549
# 5 0.0148011270 0.0301102065 3.7325039 5.59081293
# 6 0.0001622764 0.0004571717 2.0217729 4.38198852
dplyr::count(pbmc.genes, group)# 查看每个cluster中有多少基因（与矩阵的基因数一致）
#    group     n
# 1      0 18791
# 2      1 18791
# 3     10 18791
# 4     11 18791
# 5     12 18791
# 6      2 18791
# 7      3 18791
# 8      4 18791
# 9      5 18791
# 10     6 18791
# 11     7 18791
# 12     8 18791
# 13     9 18791

• 1.4 选取group0的差异基因进行GSEA分析，将cluster0的 差异基因整理为GSEA分析需要的数据格式（也可输入注释好的细胞群的差异基因）

# 仅选择fgsea的feature和auc列
cluster0.genes<- pbmc.genes %>% dplyr::filter(group == "0") %>% arrange(desc(auc)) %>% dplyr::select(feature, auc)
ranks<- deframe(cluster0.genes)
head(ranks)
# RPL30     RPS3A     RPS13    RPL35A     RPL32     RPL34 
# 0.9376551 0.9358956 0.9250745 0.9196189 0.9185743 0.9132980 

2. 选择自己数据的物种以及要做的GSEA的数据库类型，准备目标基因集的输入文件

为了进行基因集富集分析，首先需要注释基因集。一个重要的来源是Broad Institute开发的MsigDB。
网址：https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/

library(msigdbr)
library(fgsea)
library(dplyr)
library(ggplot2)
##查看物种的数据 msigdbr_show_species()；#我们使用C7免疫基因集
m_df<- msigdbr(species = "Homo sapiens", category = "C7")
head(m_df)

##将m_df的基因与通路取出并改成一个通路对应相应基因的格式
fgsea_sets<- m_df %>% split(x = .$gene_symbol, f = .$gs_name)
#以gs_name为factor对gene_symbol进行分类，统计落在每个gs_name中的gene_symbol的个数，并生成list。
summary(fgsea_sets)

3. 使用fgsea进行基因集富集并绘图

• 3.1 富集分析

fgseaRes<- fgsea(fgsea_sets, stats = ranks, nperm = 1000)
#nperm设置的是permutation次数

• 3.2 整理数据：

fgseaResTidy <- fgseaRes %>%  as_tibble() %>% arrange(desc(NES))
fgseaResTidy %>% dplyr::select(-leadingEdge, -ES, -nMoreExtreme) %>% arrange(padj) %>% head()

• 3.3 绘图

应用标准化富集分数绘制barplot

# 显示top20信号通路
ggplot(fgseaResTidy %>% filter(padj < 0.008) %>% head(n= 20), aes(reorder(pathway, NES), NES)) +
  geom_col(aes(fill= NES < 7.5)) +
  coord_flip() +
  labs(x="Pathway", y="Normalized Enrichment Score",
       title="Hallmark pathways NES from GSEA") +
  theme_minimal() ####以7.5进行绘图填色

GSEA图

plotEnrichment(fgsea_sets[["GSE10325_CD4_TCELL_VS_MYELOID_UP"]],
               ranks) + labs(title="GSE10325 CD4 TCELL VS MYELOID UP")

上图中，最上面的绿线是遍历排好序的基因列表以计算ES值的过程。遍历基因集中的基因时，当基因出现在目标基因（横轴的基因）中则加分，反之减分。加减分值由基因与表型的相关性决定。当分值积累到最大就是富集分数。
X轴是实验中的所有基因（在这里大约为20,000）。每个黑条是该基因集中的基因（途径），我们可以知道基因在排序列表中的位置。
如果基因集位于预先排列的基因列表的顶部，则通过某种度量计算出富集分数（enrichment score，ES），ES为正。如果基因集位于预先排列的基因列表的底部，则ES为负。
从以上图中可以看出多数基因都落在了峰值之前（绿线峰值）的核心基因集中，表明基因在该数据集中的显著富集，也就是高表达。

4. 常规GSEA分析

GSEA（软件）分析需要准备的文件：

• 基因表达量表（.gct / .txt）文件
• 样本分类关系表（.cls）文件
• 基因集合（.gmt）文件

• 4.1 基因表达量表文件

新建excel，将数据整理成下面的格式，存储为.txt文件。

第一列是NAME，也就是基因名；第二列是Description，全是gene即可，不需更改；后面的列是样本的表达量，需要是数值类型。

• 4.2 样本分类关系表（.cls）文件

新建excel
第一行分别是：样本数、几个分组、1(固定不需要改)
第二行分别是：#、分组1、分组2
第三行是每个组的样本，0代表CON组，1代表CASE组

将文件保存成.txt格式，随后更改后缀为.cls （一定要先保存成.txt格式，若先存成.xlsx格式再改成.cls，读入GSEA软件会报错）

• 4.3 基因集合（.gmt）文件
  人的文件可以直接从GSEA官网上下载
  小鼠的文件（以KEGG上下载的数据集做演示）：
  首先，在KEGG数据库中下载小鼠的KEGG通路数据库文件

点击mmu

点击Brite hierachy

这样就得到了下载.keg文件

先在Linux下解析keg文件

#解析信息
perl -alne '{if(/^C/){/PATH:mmu(\d+)/;$kegg=$1}else{print "$kegg\t$F[1]" if /^D/ and $kegg;}}' mmu00001.keg > mmu00001_kegg2gene.txt
grep '^C' mmu00001.keg | grep "mmu" | sed 's/^C    //g' | sed 's/\([0-9]*\)\s/\1\t/' > mmu00001_kegg2description.txt

再用R制作.gmt文件

#转换ID同时制作.gmt文件
#安装转换ID需要用到的各个R包
install.packages("data.table")
BiocManager::install("org.Mm.eg.db")
BiocManager::install("clusterProfiler")

#调用各个R包
library(data.table)
library(org.Mm.eg.db)
library(clusterProfiler)

#读入数据
path2gene_file<-"mmu00001_kegg2gene.txt"
tmp=read.table(path2gene_file,sep="\t",colClasses=c('character'))
dt <- tmp
dt$geneid <- rownames(dt)

# transform id  
map_dt <- bitr(dt$V2, fromType = "ENTREZID",toType = c( "SYMBOL"),OrgDb = org.Mm.eg.db)
dt_merge <- merge(map_dt,dt, by.y = "V2", by.x = "ENTREZID")

# 可以把转换ID后的表输出
#write.table(dt_merge, file = "example42.txt", sep = "\t", col.names = T, row.names = T, quote = F)

# first column is kegg ID, second column is entrez ID
GeneID2kegg_list<- tapply(tmp[,1],as.factor(tmp[,2]),function(x) x)
kegg2symbol_list<- tapply(dt_merge$SYMBOL,as.factor(dt_merge$V1),function(x) x)
View(kegg2symbol_list)

#输出数据，但描述列为NA
write.gmt <- function(geneSet=kegg2symbol_list,gmt_file='kegg2symbol.gmt'){
  sink( gmt_file )
  for (i in 1:length(geneSet)){
    cat(names(geneSet)[i])
    cat('\tNA\t')
    cat(paste(geneSet[[i]],collapse = '\t'))
    cat('\n')
  }
  sink()
}

write.gmt()

在上面的gmt文件里添加自定义基因集：

gene50 <- matrix$mygene[1:50]
GeneID2kegg_list$gene50 <- gene50

然后重复上面的输出gmt文件。如果只想要自定义基因集，可以在加入自定义基因集后删掉其他基因集。

• 4.4 排序文件
  前面我们得到了GSEA软件需要用的三个文件，但GSEA软件的图默认是.png，且不够清晰。如果想使用R画图，除了需要上面的.gmt文件还需要排序文件

rm(list = ls())  
options(stringsAsFactors = F)
# library(org.Hs.eg.db)
library(org.Mm.eg.db)
library(clusterProfiler)
library(enrichplot)
library(tidyverse)
library(ggstatsplot)

#读入差异分析结果
DEG_DESeq2_all <- read_excel("DEG_DESeq2_all.xlsx")

## 物种设置
organism = 'hsa'    #  人类'hsa' 小鼠'mmu'   
OrgDb = 'org.Hs.eg.db'#人类"org.Hs.eg.db" 小鼠"org.Mm.eg.db"

#### 按照需要可选择不同的DEG方法数据集 ####
need_DEG <- DEG_DESeq2_all
need_DEG <- need_DEG[,c(2,4,7)] #选择SYMBOL, log2FoldChange和pvalue（凑成数据框）

colnames(need_DEG) <- c('SYMBOL','log2FoldChange','pvalue')

##### 创建gsea分析的geneList（包含从大到小排列的log2FoldChange和ENTREZID信息）####
#转化id  
df <- bitr(need_DEG$SYMBOL, fromType = "SYMBOL",toType =  "ENTREZID", OrgDb = 'org.Hs.eg.db') #人数据库org.Hs.eg.db 小鼠org.Mm.eg.db
need_DEG <- merge(need_DEG, df, by='SYMBOL')  #按照SYMBOL合并注释信息
need_DEG <- filter(need_DEG,need_DEG$log2FoldChange!='Inf')
need_DEG <- filter(need_DEG,need_DEG$log2FoldChange!='=Inf')
geneList <- need_DEG$log2FoldChange
#geneList <- as.numeric(geneList)
names(geneList) <- need_DEG$ENTREZID
geneList <- sort(geneList, decreasing = T)   #从大到小排序

这样得到的是以ENTREZID命名的"numeric"，接下来就可以进行常规GSEA分析

##### gsea富集 ####
KEGG_kk_entrez <- gseKEGG(geneList     = geneList,
                          organism     = 'mmu', #人hsa 鼠mmu
                          pvalueCutoff = 0.25)  #实际为padj阈值,可调整 
KEGG_kk <- DOSE::setReadable(KEGG_kk_entrez, 
                             OrgDb=OrgDb,
                             keyType='ENTREZID')#转化id             

GO_kk_entrez <- gseGO(geneList     = geneList,
                      ont          = "ALL",  # "BP"、"MF"和"CC"或"ALL"
                      OrgDb        = 'org.Mm.eg.db',#人类org.Hs.eg.db 鼠org.Mm.eg.db
                      keyType      = "ENTREZID",
                      pvalueCutoff = 0.25)   #实际为padj阈值可调整
GO_kk <- DOSE::setReadable(GO_kk_entrez, 
                           OrgDb=OrgDb,
                           keyType='ENTREZID')#转化id 

#save(KEGG_kk_entrez, GO_kk_entrez, file = "GSEA_result.RData")


###可视化
##选取富集结果
kk_gse <- KEGG_kk
kk_gse_entrez <- KEGG_kk_entrez

###条件筛选 
#一般认为|NES|>1，NOM pvalue<0.05，FDR（padj）<0.25的通路是显著富集的
kk_gse_cut <- kk_gse[kk_gse$pvalue<0.05 & kk_gse$p.adjust<0.25 & abs(kk_gse$NES)>1]
kk_gse_cut_down <- kk_gse_cut[kk_gse_cut$NES < 0,]
kk_gse_cut_up <- kk_gse_cut[kk_gse_cut$NES > 0,]

#选择展现NES前几个通路 
down_gsea <- kk_gse_cut_down[tail(order(kk_gse_cut_down$NES,decreasing = T),10),]
up_gsea <- kk_gse_cut_up[head(order(kk_gse_cut_up$NES,decreasing = T),10),]
diff_gsea <- kk_gse_cut[head(order(abs(kk_gse_cut$NES),decreasing = T),10),]


#### 经典的GSEA图 
up_gsea$Description
i=2
gseap1 <- gseaplot2(kk_gse,
                    up_gsea$ID[i],#富集的ID编号
                    title = up_gsea$Description[i],#标题
                    color = "red", #GSEA线条颜色
                    base_size = 20,#基础字体大小
                    rel_heights = c(1.5, 0.5, 1),#副图的相对高度
                    subplots = 1:3,   #要显示哪些副图 如subplots=c(1,3) #只要第一和第三个图
                    ES_geom = "line", #enrichment score用线还是用点"dot"
                    pvalue_table = T) #显示pvalue等信息
gseap1
ggsave(gseap1, filename = 'GSEA_up_1.pdf', width =10, height =8)

#### 合并 GSEA通路 
gseap2 <- gseaplot2(kk_gse,
                    up_gsea$ID,#富集的ID编号
                    title = "UP_GSEA_all",#标题
                    color = "red",#GSEA线条颜色
                    base_size = 20,#基础字体大小
                    rel_heights = c(1.5, 0.5, 1),#副图的相对高度
                    subplots = 1:3, #要显示哪些副图 如subplots=c(1,3) #只要第一和第三个图
                    ES_geom = "line",#enrichment score用线还是用点"dot"
                    pvalue_table = T) #显示pvalue等信息
gseap2 
ggsave(gseap2, filename = "GSEA_up_all.pdf",width =12,height =12)

但如果想使用4.3中的自定义gmt文件，则需要注意，如果生成的gmt文件下使用的是基因SYMBOL，则上面构建排序文件时不需将SYMBOL转换成ENTREZID。
在差异分析结果中取出'SYMBOL'和'log2FoldChange'后，将SYMBOL去重复，再单独取出log2FoldChange的值，使用SYMBOL去对log2FoldChange命名，然后按log2FoldChange排序即可。

need_DEG=need_DEG[duplicated(need_DEG$SYMBOL)==FALSE,]
geneList <- need_DEG$log2FoldChange
names(geneList) <- a$SYMBOL
geneList <- sort(geneList, decreasing = T)

随后就可以使用fgsea进行分析了

#pathway是读入的.gmt文件
fgseaRes <- fgsea(pathway, geneList, minSize=15, maxSize=500, nperm=1000) 
fgseaResTidy <- fgseaRes %>%  as_tibble() %>% arrange(desc(NES))
fgseaResTidy %>% dplyr::select(-leadingEdge, -ES, -nMoreExtreme) %>% arrange(padj) %>% head()
plotEnrichment(pathway[["gene50"]],geneList) + labs(title="gene50")

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✨该教程中的一些小细节：

1. wilcoxauc函数
这个函数来自presto包，可以基于高斯近似法计算Wilcoxon p值和auROC。可以输入Dense matrix/data.frame，Sparse matrix比如dgCMatrix，Seurat V3对象和SingleCellExperiment对象。

2. dplyr：
参考：dplyr包的函数及用法
这里使用到了dplyr包中的4个函数：
filter函数：针对行进行操作，提取一个或多个分组变量中的某个观测
arrange函数：针对某个变量对矩阵进行排序，默认升序
select函数：针对列进行操作，提取指定的一或多列
count函数：对数据集中某个分组变量的各个观测值的数量进行统计

3. fgsea函数：
fgsea能够快速对预选基因集进行GSEA富集分析，预选基因集可以是自己设定，一般使用MSigdb数据库（同样由提出GSEA方法团队提供）。
fgsea（）函数需要一个基因集列表以及对应值，主要是基因名和AUC(ROC曲线下方的面积大小，简单说就是代表准确性，准确性越高，AUC值越大)，其中基因集中的基因名要与数据集（pathway）中的基因名相对应。
fgsea包中的plotEnrichment函数用于GSEA图的绘制。
fgsea函数详细参考：https://stephenturner.github.io/deseq-to-fgsea/

4. msigdbr：
参考：基因功能富集方法和基因注释数据库介绍