最近在学习利用转录组数据进行变异检测的相关分析方法，找到了一篇关于samtools的教程SAMtools - Primer / Tutorial，原文提供分析过程用到的数据，非常好的学习素材，简单记录自己的重复过程。（前两天试着用conda安装了samtools-1.8-3, 但是使用的时候遇到了报错
暂时先不管它了，用之前安装的samtools-1.5来重复本次教程；conda之前好长一段时间都不能用，这几天又突然可以用了，搞不懂什么原因）
PS:看完原文教程以后发现内容非常熟悉，仔细想想原来是老师上课讲过的一个实例！
典型的二代测序数据分析流程主要包括五个步骤（A typical work-flow for next-generation sequence analysis is usually composed of the following steps:）
1 DNA is extracted from a sample(DNA提取)
2 DNA is sequenced.(测序)
3 Raw sequencing reads are aligned to a reference genome(reads比对到参考基因组)
4 Aligned reads are evaluated and visualized.(比对结果评估和可视化)
5 Genomic variants, variants, including single nucleotide polymorphisms (SNPs), small insertions and deletions are identified(SNP,Indel检测)
步骤4，5用到 samtools
本次教程的流程（workflow）主要包括5个步骤
1 Align the reads to the reference E.coli genome with Bowtie2(比对reads到参考基因组)
2 convert the aligned reads from the SAM file format to BAM(将SAM格式转换为BAM格式)
3 sort and index the BAM file (index该怎么翻译呢？)
4 identify genomic variants(变异检测)
5 visualize the reads and genomic variants(可视化)
（接下来原文用wgsim模拟生成了原始的reads，直接跳过这一部分）
Bowtie2将reads比对到参考基因组之前，首先要index参考基因组
Bowtie 2: Manual 这个链接是Bowtie2的帮助文档，内容非常详细，只是要看懂还得费些力气
index参考基因组用到的命令是 bowtie2-bulid (命令后的参数很多自己也还有很多参数没有搞懂)，通常直接用默认参数，用到的命令为 bowtie2-build input_file.fasta output_index_name
试了好几次一直报错也没发现问题出在哪，最后才知道实验室的服务器没有存储空间了，甚至用mkdir命令新建目录都告诉我permission denied了
接下来是用bowtie2命令将reads比对到参考基因组
-x参数指定index后的参考基因组位置 -U reads所在的位置 -S 指定输出文件的位置及文件名
这个是单端数据，如果是PE 用-1和-2分别指定reads
接下来原文介绍了sam文件的格式，记得生物信息学课程考试考了这个题，自己好像没有写出来（这个格式现在的自己也没有太明白，得抽时间仔细看好好理解啦！）
我们的目标是鉴定基因组变异，第一步要做的是将sam转换为bam,下游的分析需要BAM文件作为输入(our goal is to identity the set of genomic variants within the E.coli data set. To do so, our first step is to convert the SAM file to BAM. This is an important prerequisite, as all the downstream steps, including the identification of genomic variants visualization of reads, require BAM as input)
转换sam为bam用到samtools view 命令
接下来是sort和index bam文件，分别用到samtools sort 和 samtools index
sort的时候可能因为samtools的版本不一样重复原文命令会遇到报错，需要我们自己加上一个 -o 参数指定输出文件
现在有了bam文件和参考基因组，试着将比对结果可视化一下，用到IGV
通过2导入参考基因组fasta文件，通过1导入index后的bam文件（index时生成的后缀为fai的文件也必须同时存在），通过4和5 可以缩小和放大参考基因组显示的区域，通过改变3破折号前后的数字可以选择要展示的基因组区域（IGV好像还有很多小工具有机会可以探索一下）
IGV查看比对结果所用到的文件 百度云链接密码 il9q
第一次接触IGV是在跟着生信技能树论坛学习转录组数据分析的时候，当时用IGV查看比对的结果没有成功，后来也没有在尝试，回头想一想，都过去一年多的时间了......
变异检测
第一步使用samtools mpileup 计算 the genotype likelihoods supported by the aligned reads in our sample
然后用bcftools来检测变异（另外抽时间再来看这块吧）