1130 RNAseq生物信息分析（王通老师）
01课程介绍
[if !supportLists]1. [endif]RNAseq测序定义
[if !supportLists]2. [endif]为什么要进行RNA测序
机体DNA是一个相对静态的过程，RNA是一个动态变化的过程，其在生理病理或者外在条件下，会发生相应变化，影响调控疾病发生。所以解释RNA变化在生命科学中是非常重要而这时候就需要RNAseq了。DNA是静止的，RNAseq是动态的拍照
[if !supportLists]3. [endif]RNA seq文章数量统计说明RNAseq的重要性
[if !supportLists]4. [endif]RNAseq应用（1.生命科学研究 2.医学研究 3.农业领域）
[if !supportLists]5. [endif]RNAseq课程大纲，王老师打算怎么讲（包括基础知识与实操）
[if !supportLists]6. [endif]RNAseq课程能够收获啥 （1.提高阅读RNAseq文献的能力 2.轻松理解RNA seq结题报告 了解RNAseq数据分析过程 4.合理设计RNAseq研究方案）
[if !supportLists]7. [endif]本课程提供什么（配套练习+配置好环境的服务器+脚本）
02RNAseq测序技术概述
[if !supportLists]1. [endif]转录组定义：广义(全部转录本的总和)与狭义（mRNA）；特点是具有特定的空间性与时间特征。对于转录本的分析分为定性与定量两个方面 转录组是一个拍照，动态过程.不同细胞功能不同，很大原因是因为转录组不同。
[if !supportLists]2. [endif]中心法则（DNA<---->RNA---蛋白质） mRNA称为coding RNA,与蛋白编码相关，其余RNA称为非编码RNA。 人类基因组上只有10%是基因区，而基因区只有不到1.5%，其余90%都认为是无用的。但存在即合理，这些非编码区RNA也能够影响基因表达，影响表型。
[if !supportLists]3. [endif]各类RNA在转录中的含量（真核RNA与原核RNA rRNA 80% tRNA15% mRNA 5% lncRNA等占1%左右）
[if !supportLists]4. [endif]RNAseq分类（1.测序物种（原核与真核）2.建库测序类型（常规与链特异性）3.有无参考序列（有参序列与RNA seq denovo） 4测序目标（外显子测序；lncRNA测序；测序小RNA测序等））
[if !supportLists]5. [endif]RNAseq与DNAseq之间的差异（选择根据研究目的--比较物种差异，遗传的系统发育 SNP与InDel等可以选择RNA seq； RNA是动态变化的，不同条件下基因表达差异通过RNA测序完成，因为短时间内DNA不会发生变化，可变剪接与融合基因等也必须使用RNAseq去检测）RNA seq只捕获转录出来的信息，真核生物中转录出来的信息占基因组很小一部分比例，人的话大概3G，10%与转录有关，1%为编码区。测DNA需要测30G信息，RNAseq测序测6G就可以了，测外显子数据，只需要捕获其1%的数据，30多M就行。
03RNAseq发展历史（基于高通量测序）
1.RNA检测发展史
qPCR(金标准但是表达量低)---->EST（表达序列标签，随机片段可以用于发现新的转录本）
---->基因表达连继续分析技术（SAGE），能同时对上千个转录物进行研究（1. 9~10个碱基的短核苷酸标签序列（人类基因组只能表达8万个左右的转录本）；2. 短片段标签相互链接，形成长的DNA分子，则对该克隆进行测序将得到大量连续的单个标签，这样就可以对数以千记个mRNA转录本进行分析,类似于DGE) ------> 基因芯片技术（Microarry---在高通量测序出来之前，芯片是主要的大规模转录本表达分析技术）通过将几十万个不等的探针固定在约1厘米见方的固体片基上支撑的（厉害，这些科学家时真的厉害），利用核苷酸分子在形成双链时碱基互补配对原理，microarry可以一次性的检测出所有与探针互补的核苷酸片段，从而快速得到样本基因的表达谱。便宜但只能检测已知基因，且不容易定量。----->数字基因表达谱（DGE）也是通过捕获标签实现的，真核生物没有相应的DGE标签，所以不能使用。----> 转录组测序
[if !supportLists]2. [endif]技术缺陷（主要从这四个方面去观察）
[if !supportLists]（1. [endif]需要依赖已知参考序列，若无，就无法捕获
[if !supportLists]（2. [endif]通量低，一次不能捕获全部转录情况
[if !supportLists]（3. [endif]只能定性，不能定量，只能确定有无，不能确定多少
[if !supportLists]（4. [endif]不适合于所有物种
RNA seq一定程度上可以解决这些技术缺陷
[if !supportLists]3. [endif]RNAseq与芯片的比较（检测低表达基因；检测基因数；检测阈值；噪音；准确性；可重复性；）
[if !supportLists]4. [endif]几种基因表达定量技术的比较（上面10个参数，归纳完全够了）
[if !supportLists]5. [endif]RNAseq技术优势
（1 RNAseq测序直接得到的时核酸序列信息（尤其注意，所以可以做融合基因与可变剪辑等，分析源于此处。。太傻了，不要只有概念，只听说过，却不知道为什么，不要脑子麻木了），除了可以得到基因表达量，还可以检测RNA的结构与结构变异。
（2 开放的转录组分析：无需参考基因组信息；无需设计探针，不但能检测已知基因，还能发现新的转录本
（3 在测序覆盖度足够大时能够检测到细胞中的低丰度转录本。
（4 随着测序深度增加，可以获得更广的动态检测范围，能够同时鉴定高丰度与低丰度转录本，定量和定性都更加准确。
04 关于基因的概念（概念是你理解一个东西的基础，冯唐老师的500个专业词汇对于一个行业的大致了解，其实就是这个原因，基础不牢，地动山摇）
[if !supportLists]1. [endif]需要了解的概念：（基因，开放阅读框（ORF），mRNA,转录本，外显子，内含子，CDS，Sform（可变剪切产生的亚型）），了解它们的同与不同
[if !supportLists]2. [endif]基因的概念广义（控制生物体性状的基本单位）与狭义(基因组上完成固定功能的区域)，之前认为1个基因对于1个蛋白质，这明显是错误的，因为基因存在可变剪切，不同外显子可以组成不同的转录本。人有40000个基因，但是能够组成100000个以上蛋白质，这也是同一种细胞能够分化成不同形态的物质基础。现常将转录出来的非编码蛋白区域称为基因，甚至包含编码区上下游的调控区域也称为基因。
[if !supportLists]3. [endif]原核生物基因结构示例：（打印出来，那我总得记住你吧）
真核生物基因结构示例：
[if !supportLists]4. [endif]编码区一定是ORF，但ORF不一定是编码区。并非起始密码子开头，终止密码子结尾的序列就具有生物学功能，一般来说1/6的ORF才是编码区（为什么是1/6呢，因为基因读码的序列，正义链起始密码子3个碱基，每一个都能作为开头；反义链起始密码子也有3个碱基，每一个也都能作为结尾，可以产生6个ORF）
[if !supportLists]5. [endif]人类基因组有10%是基因区，只有1%是编码区，因为基因区包含大量的内含子。真核生物普遍存在可变剪切（外显子进行重新组合，组合在一起再接着形成蛋白质，所以靶基因的RNA不可能是一条长长的链，像DNA一样，其有一个组合的过程。。傻了，当时和狗儿所争执的，还是基础不牢固导致的）
认真比对一下未成熟RNA与成熟mRNA吧，认真看一下mRNA的成熟过程（切除UTR，切除内含子，补上5’的帽子与3’的多聚A）。
05 RNAseq样品提取与处理（这是起始过程，决定后续的一切（包括数据分析与产生结果等））
[if !supportLists]1. [endif]RNAseq总实验流程
总RNA提取----》mRNA富集----》cDNA文库制备-----》上机测序
（1 每一步细讲，提取方法：两种（1.Trizol 2.试剂盒）注意提取的纯度与浓度 检测提取效果：电泳18S条带与28S条带，28S条带是18S条带的两倍亮。量要求细胞rna至少要1ug）
（2 样品检测结果解读：只有1-2个峰合格，具有多个峰则表明发生降解。检测结果分类：分为A、质量可以，总量也够两次以上 B 质量可以，总量不够两次以上
C 质量不可以，总量也够两次以上（有建库风险）D 质量不可以，总量也不够两次以上（不建议建库）
样品的总量与纯度等都影响建库
mRNA富集，为什么要富集呢？因为95%的rRNA与tRNA分析是无意义与无效的（但可不可能元件rRNA与运输工tRNA也能影响生物形状呢，毕竟其也是发挥作用的呢？），对于mRNA与非编码且发挥作用的RNA有相应的方法进行富集，去除不需要的RNA，有相应的方法对rRNA与tRNA进行消除。最常见的是Oligo DT富集还有rRNA消除法
OligoDT的优点：富集效率高，不存在核糖体污染；缺点：只适合真核生物，丢失一些ncRNA信息
rRNA消除方法优点：适合于所有物种，除留下mRNA之外，还会保留一些重要的ncRNA
缺点：富集效率低，会存在rRNA污染。
06 RNAseq建库测序：测序得到的结果是ATCG四种碱基
[if !supportLists]1. [endif]建库测序之前，还需要将mRNA反转录成cDNA,最终测ATCG四种序列
[if !supportLists]2. [endif]思考是先反转录，后打断；还是先打断后反转录？（其实都可以，但存在一个效率问题）
也就是打断容易还是反转录容易，其实是打断容易，不管是DNA还是RNA，使用超声波打断其实是差不多的，反转录前后打断没有影响。那就变成了反抓录长的容易还是反转录短的容易。显然对短的反转录效率更高。
[if !supportLists]3. [endif]两种方法比较：结果显示显然是先打断后反转录效果更好（标签数与基因数）
[if !supportLists]4. [endif]文库大小的选择