2022-10-24

Cellular Mol Immu | 凋亡癌细胞与成纤维细胞相互作用影响癌转移

原创 骄阳似我 图灵基因 2022-10-24 10:35 发表于江苏

收录于合集#前沿分子生物学机制

撰文：骄阳似我

IF：22.096

推荐度：⭐⭐⭐⭐⭐

亮点：

凋亡癌细胞与肿瘤微环境之间的相互作用调节肿瘤的进展和转移。癌症相关成纤维细胞（CAFs）通过旁分泌通信在促进这些事件中起着关键作用。本文证明了暴露于凋亡癌细胞的肺CAFs的条件培养基（CM）可以抑制TGF-β1诱导的癌细胞的迁移和侵袭。

肺癌是全球最常见的癌症类型，近75%的肺癌患者在诊断时表现为局部晚期或转移性疾病。转移是一个多步骤的过程，涉及到癌细胞的迁移和侵袭。具有不同来源的癌相关成纤维细胞（CAFs）是肿瘤相关间质中存在的主要细胞类型之一。CAFs与癌细胞之间的旁分泌通信促进了癌细胞的迁移和侵袭等过程，从而促进肿瘤进展为恶性肿瘤和转移扩散。CAFs在肿瘤间质基质中的基质，允许癌细胞侵袭，同时仍然保持其上皮特性。然而，CAFs控制肿瘤进展的分子机制尚不清楚。

近期，Jihee Lee Kang等研究人员在Cellular & Molecular Immunology杂志上发表了一篇名为“Reprogramming of cancer-associated fibroblasts by apoptotic cancer cells inhibits lung metastasis via Notch1-WISP-1 signaling ”的文章，研究了CAFs与凋亡肺癌细胞的相互作用如何调节癌细胞的迁移和侵袭，还研究了单次注射凋亡肺癌细胞是否以及如何抑制同基因免疫活性小鼠的CAF激活和肺转移。此外，从暴露于凋亡肺癌细胞的CAFs中收集条件培养基（CM），以评估其对肿瘤进展和肺转移的抑制作用。

CAFs暴露于凋亡癌细胞的CM可抑制癌细胞的迁移和侵袭

CAFs与癌细胞之间的旁分泌通信促进了癌细胞的迁移和侵袭。故本文首先研究了CAFs暴露于紫外线照射下的凋亡癌细胞是否会通过分泌生物活性介质来抑制肺癌细胞的迁移和侵袭。结果发现ApoSQ-CAF CM可以阻止TGF-β1诱导的癌细胞迁移和侵袭，而对照组（CAF CM）或NecSQ-CAF CM则不能。无论是ApoSQ还是NecSQ直接暴露都不会影响344SQ细胞的迁移或侵袭。

TGF-β信号通路的激活通过调节Smad依赖和Smad不依赖的通路来诱导癌细胞的迁移和侵袭。这些途径可调节癌细胞和肿瘤基质相关细胞中基质金属蛋白酶（MMPs）的活性。特别是，MMP2和MMP12已被证明可以降解ECM的成分，并与肺癌转移相关。本研究发现ApoSQ-CAF CM阻断了344个SQ细胞中的TGF-β1信号通路，包括通过Smad2/3、ERK、Src、p38 MAP激酶、FAK和Akt通路的信号通路。ApoSQ-CAF CM还逆转了TGF-β1信号通路诱导的MMP-2和MMP-12在mRNA和蛋白水平上表达的上调。

综上所述，暴露于凋亡癌细胞的CM通过抑制TGF-β1信号相关通路以及MMP-2和MMP-12的表达来抑制肺癌细胞的迁移和侵袭。图1：暴露于凋亡肺癌细胞的CAFS CM抑制TGF-B1信号通路和肺癌细胞的迁移和侵袭。

CAFs与凋亡肺癌细胞的相互作用抑制了CAF的迁移和侵袭。

CAFs的迁移能力取决于其激活状态。本研究发现直接暴露于ApoSQ可以抑制TGF-β1诱导的迁移和侵袭，而暴露于NecSQ则没有抑制作用。与ApoSQ的直接作用相似，ApoSQ-CAF CM也抑制了TGF-β1诱导的CAFs的迁移和侵袭，而NecSQ-CAF CM则没有抑制作用。

ApoSQ抑制了TGF-β1诱导的CAF激活标志物α-平滑肌肌动蛋白（SMA）、1型胶原蛋白和纤维连接蛋白的mRNA和蛋白的表达。

CAFs最广泛使用的标记物是α-SMA，因为该蛋白是肌成纤维细胞的特异性标记物。免疫细胞化学分析的结果证实，ApoSQ暴露可降低CAFs中α-SMA蛋白的表达，而NecSQ暴露则不能降低。同样，ApoSQ抑制了TGF-β1诱导的CAFs中Smad和非Smad信号通路的激活。ApoSQ还降低了TGF-β1诱导的MMP-2和MMP-12在mRNA和蛋白水平上的表达。

综上所述，CAFs与凋亡肺癌细胞的相互作用通过抑制TGF-β1信号通路以及MMP-2和MMP-12的表达来抑制CAF的迁移和侵袭。图2 ：CAFS和凋亡肺癌细胞之间的相互作用抑制TGF-B1信号传导、迁移和侵袭以及CAFS中活化标记物的表达。

344SQ细胞中整合素αvβ3和CAFs中αvβ5的WISP-1信号抑制TGF-β1诱导的迁移和侵袭

暴露于ApoSQ的CAFs分泌的WISP-1介导了对肺癌细胞和CAFs的抗迁移和抗侵袭作用,在本研究中，为了鉴定介导344SQ细胞和CAFs中WISP-1功能的特异性整合素，使用了针对整合素αv、α5、β1、β3或β5的阻断抗体。与对照组IgG相比，用抗整合素αv或β3抗体预处理344SQ细胞，显著逆转了rWISP-1的抗迁移和抗侵袭作用。在CAFs中，与对照组IgG相比，使用抗整合素αv或β5抗体治疗后，未观察到rWISP-1的抑制作用。值得注意的是，用抗整合素α5、β1或β5抗体预处理344SQ细胞，用抗α5、β1或β3抗体预处理CAFs，对细胞迁移和侵袭的影响很小。

接下来进一步研究了WISP-1是否在344SQ细胞中通过整合素αv和β3以及在CAFs中通过整合素αv和β5抑制TGF-β1诱导的信号通路。与预期的一样，用抗整合素αv或β3抗体预处理344SQ细胞，也减弱了rWISP-1对TGF-β1诱导的信号通路以及对MMP2/MMP12 mRNA和蛋白表达的抑制作用。在CAFs中，使用抗整合素αv或β5抗体治疗逆转了rWISP-1的这些抑制作用。

综上所述，这些结果证实了WISP-1主要通过344SQ细胞中的整合素αvβ3受体和CAFs中的整合素αvβ5受体在自分泌和旁分泌方式中，进一步阻断TGF-β1诱导的信号通路发挥关键作用。图3：WISP-1通过344SQ细胞中的整合素AVB3和CAFS中的avp5抑制TGF-β1诱导的迁移和侵袭。

凋亡的癌细胞触发Notch1信号通路，从而产生WISP-1

Notch1-WISP-1轴控制着间质成纤维细胞在黑色素瘤侵袭和转移中的调节作用。推测ApoSQ诱导的Notch1-WISP-1信号通路在肺癌细胞和CAFs的抗迁移和抗侵袭作用中起着至关重要的作用。为了验证这一假设，首先研究了CAFs中的Notch1信号是否被ApoSQ刺激激活。Western blot分析显示，ApoSQ增强了Notch胞内结构域1（NICD1）的表达，后者仅在Notch1通路激活时释放，以及Notch通路的下游靶点Hes1和WISP-1的表达；此外，它还增加了WISP-1的分泌。暴露于ApoSQ后，Hes1和WISP-1 mRNA的表达水平也增加了，而NecSQ暴露后则没有这种影响。一致的是，暴露于ApoSQ 20小时后，Notch反应报告基因4×CSL-Luc的活性增加，这是Notch信号的普遍转录效应，而NecSQ暴露并没有诱导这种活性。此外，免疫细胞化学分析显示，暴露于ApoSQ的CAFs中NICD1和WISP-1染色增强，WISP-1染色与NICD1染色共定位。

利用Notch1 siRNA和一种药物抑制剂，进一步证实了ApoSQ诱导的Notch1-WISP-1信号通路介导了344SQ细胞和CAFs的迁移和侵袭。Notch1敲低逆转了ApoSQ诱导的NICD1、Hes1和WISP-1蛋白表达和WISP-1分泌的增加，这与抑制ApoSQ-CAF CM对344SQ细胞的抗迁移和抗侵袭作用有关和ApoSQ的暴露。

为了研究激活Notch1信号通路所需的细胞表面相互作用，首先检测了凋亡细胞表面Notch配体的表达。Dll1在凋亡癌细胞中在紫外线照射下表达增强，包括344SQ、A549和HCT116细胞。然而，其他配体的表达要么没有变化，要么有所下降。Western blot证实，Dll1的表达仅在凋亡癌细胞的裂解液中增加。用抗Dll1抗体中和ApoSQ表面的Dll1，减少了ApoSQ诱导的CAFs中的Notch1信号通路和WISP-1分泌。同样，在紫外线照射诱导细胞凋亡之前，通过转染特异性siRNA转染344SQ细胞中的Dll1，可以抑制ApoSQ中Notch1的激活和WISP-1的分泌。

综上所述，这些数据表明，凋亡的肺癌细胞触发Notch1信号，促进CAFs中WISP-1的产生，从而阻止肺癌细胞和CAFs的迁移和侵袭。CAFs中的Notch1信号通路是通过与邻近表达Dll1的凋亡癌细胞相互作用而启动的。图4：凋亡性肺癌细胞通过增强Dll1表达，触发Notch1信号传导，在CAFS中产生WISP-1。

BAI1/Rac1信号通路促进CAFs的气泡吞噬作用，并参与Notch1信号通路的串扰

脑特异性血管生成抑制剂1（BAI1）有助于原代成纤维细胞对凋亡的宫颈癌细胞的吞噬。因此研究了促进凋亡肺癌细胞摄取的BAI1信号通路是否影响CAFs中的Notch1信号通路。一些证据表明，BAI1的血栓反应素1型重复序列在直接磷脂酰丝氨酸（PtdSer）识别和吞噬凋亡靶点中发挥了作用。因此首先研究了是否通过添加与凋亡细胞表面暴露的PtdSer结合的膜联蛋白V来阻断CAF中BAI1和ApoSQ之间的相互作用，从而抑制Notch1信号传导。

结果表明添加膜联蛋白V抑制了CAF对ApoSQ的吞噬，但ApoSQ诱导的CAF中的Notch1激活和WISP-1分泌被下调。而敲除BAI1减弱了CAFs的吞噬活性，ApoSQ处理后的Notch1信号通路和WISP-1分泌下调。相反，由于过表达BAI1的CAFs对ApoSQ的摄取率高于模拟转染的细胞，CAFs中过表达BAI1进一步增强Notch1信号和WISP-1分泌。综上所述，这些结果表明，ApoSQ结合蛋白BAI1参与了Notch1信号通路，从而刺激CAF WISP-1的产生和气泡吞噬作用。

使用Rac1抑制剂NSC23766进一步研究了CAFs中的气泡细胞活性与Notch1信号通路之间的关系，该抑制剂下调了凋亡细胞的吞噬活性。ApoSQ暴露以时间依赖的方式增强了CAFs中的Rac1活性，在24小时达到峰值。共聚焦显微镜证实了100 μM NSC23766处理降低了CAFs的吞噬活性，这也减少了Notch1信号通路和WISP-1的分泌。Notch1的敲低降低了Rac1的活性，导致CAFs减少了ApoSQ的气泡状吞噬作用。同样，20 μM DAPT在暴露24小时后抑制了Rac1活性。总的来说，这些结果为凋亡癌细胞刺激下Notch1和BAI1-Rac1通路之间的正向串扰提供了证据。图5： BAL1/Rac1信号促进传出细胞增生，并参与CAFS中Notch1信号的串扰。

在体内注射ApoSQ可增强WISP-1的产生，并通过Notch1信号通路抑制CAF的激活和肺转移

为了证实Notch1-WISP-1信号通路在体内CAF激活和肿瘤进展中的抑制作用，从注射ApoSQ的前一天开始，Notch1选择性抑制剂LY3039478（8 mg/kg），每周口服3次，持续6周。与对照组和ApoSQ组相比，LY3039478没有改变体重、原发肿瘤重量或原发肿瘤体积。然而，LY3039478逆转了ApoSQ诱导的肺表面肿瘤结节数量的减少和转移率的降低。LY3039478还逆转了ApoSQ诱导的++中CAF标记物、MMPs、生长因子和趋化因子mRNA表达水平的降低，以及Notch1和Notch下游靶基因mRNA表达水平的增加。图6：凋亡肺癌细胞注射对小鼠CAF活化和转移的Notch1信号依赖性抑制作用。

此外，对原发肿瘤组织的连续切片的免疫组化分析显示，LY3039478逆转了Thy1+ CAFs中α-SMA表达的减少和NICD1和WISP-1表达的增加。用缓冲液给予LY3039478没有这种效果。对从原发肿瘤中分离出的Thy1+ CAFs的免疫细胞化学分析证实了其蛋白表达的改变。在ApoSQ + LY3039478组中，Thy1+ CAF培养基和经ApoSQ处理的小鼠血清中WISP-1蛋白水平的升高被逆转。然而，ApoSQ和ApoSQ + LY3039478组的CD326+肿瘤细胞和CD11b+ TAMs培养基中WISP-1的水平没有变化。注射ApoSQ后，CD326+肿瘤细胞和Thy1+ CAFs的迁移和侵袭能力减少。同样，注射ApoSQ抑制了CD326+肿瘤细胞中迁移和侵袭相关信号通路的激活，包括Smad2/3、FAK、EAK、Akt通路，以及CD326+肿瘤细胞中MMP2和MMP12的蛋白表达。然而，LY3039478逆转了注射ApoSQ的效果。

综上所述，这些结果表明，单次注射ApoSQ可抑制CAFs的激活，但可增强CAFs中的Notch1-WISP-1信号通路。此外，通过注射ApoSQ靶向CAFs中的Notch1- WISP-1信号通路可能在抑制CAF的激活和转移中发挥关键作用。图7： Notch1信号传导的抑制逆转了体内WISP-1生成的增加以及迁移、侵袭和信号传导途径的抑制。

综上所述，本研究认为紫外线照射下的凋亡肺癌细胞在CAFs中触发Notch1-WISP-1信号通路，从而阻止癌细胞和CAFs的迁移和侵袭。BAI1/Rac1和Notch1信号通路参与正串扰，以维持最佳的CAF气泡细胞能力和同时产生WISP-1。一致的是，体内数据表明，单次注射ApoSQ可靶向CAF，增强Notch1-WISP-1信号通路，导致侵袭性较低的CAF表型并减轻肺转移。此外，使用ApoSQ-CAF CM或rWIPS-1可抑制肿瘤生长、肿瘤细胞和CAFs的迁移和侵袭，以及转移的发展。这些数据证实了本文的假设，即ApoSQ-CAF CM的肿瘤拮抗作用是由WISP-1强烈介导的。因此，靶向CAFs的凋亡癌细胞治疗或无细胞治疗，如使用暴露于CAFs的凋亡癌细胞的CM和WISP-1等CM成分，可能是抑制肺癌进展和转移的有效治疗方法。

教授介绍：

Jihee Lee Kang

Jihee Lee Kan于1960年1月2日出生于韩国首尔。Cheonjoon Lee和Keungsook Kim的女儿。1984年，获得韩国首尔梨花女子大学医学博士学位。1990年，获得西弗吉尼亚大学哲学博士学位。1990年-1991年任职西弗吉尼亚大学研究员，1994年-1998年任职梨花女子大学助理教授，1998年-2003年任职副教授，1998年-2000年任职梨花女子大学医学院副院长，自2003年起正式成为教授。

同时，2000年担任西弗吉尼亚州摩根敦国家职业安全与健康研究所客座教授，2003年-2004年就职于丹佛国家犹太医学与研究中心。Jihee Lee Kang被Marquis Who列为值得注意的医学教育者，同时也是韩国生理学会会员（1998年上升研究员奖）。

参考文献：

Kim, H.J., Yang, K., Kim, K.et al. Reprogramming of cancer-associated fibroblasts by apoptotic cancer cells inhibits lung metastasis via Notch1-WISP-1 signaling. Cell Mol Immunol (2022). https://doi.org/10.1038/s41423-022-00930-w