基因工程实验Ⅱ大肠杆菌质粒DNA的抽提及检测『Protocol』

一、实验原理:

质粒的抽提与纯化实质上是将质粒DNA与细菌的基因组染色体DNA、RNA、蛋白质、细胞膜等细 胞器及其他大分子物质分离的过程,因此质粒的抽提大致可分为:细菌的培养、收集与裂解;质粒DNA 的分离与纯化;浓度、纯度的鉴定三个过程。

①染色体DNA的去除:在富集培养目标菌种后,首先应裂解细菌细胞,采用含有SDS的NaOH溶液裂解菌体释放质粒,同时氢氧化钠的强碱性,可使DNA氢键断裂,双螺旋结构破坏而变性,再加入中和缓冲液,可使部分变性的质粒DNA复性,而染色体DNA不复性,因此使质粒DNA与染色体 DNA分离开。

②细菌中的RNA可以通过RNaseA去除

③蛋白质的去除:细菌中的蛋白质可以通过酚/氯仿/异戊醇抽提,酚可以使蛋白质变性,氯仿将微溶 于水的酚抽提到有机相中,使其与水相中的DNA分离。分离后的质粒DNA可以通过乙醇回收,乙醇可以消除核酸水化层,暴露其带负电的磷酸基团,因 此在阳离子充足的环境中可以发生”核酸–乙醇沉淀

④蛋白质、染色体DNA、细胞碎片、以及在分离过程中与试剂形成的不溶复合物都可以通过离心去除。

⑤试剂盒法DNA的回收:除碱裂解法以外,还可以通过试剂盒抽提质粒DNA,在碱裂解进行变性和复性后的纯化回收通过纯化柱进行。纯化柱中的硅胶膜能在高盐、低PH条件下吸附体系中的 DNA,将其与其他杂志分离,而在低盐、高PH条件下DNA又可以被洗脱下来。

⑥纯化后的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳或紫外分光光度计鉴定

电泳法:带负电荷的DNA分子在外加电场的作用下向正极泳动,不同分子量大小与构型的DNA分子泳动速率不同,因此可以在琼脂糖凝胶上呈现不同的条带。在凝胶中加入核酸染料可以方便我们观察,因为核酸染料可以嵌入到DNA碱基之间,避免被凝胶中的氢离子淬灭,因而亮度更高。

紫外分光光度法:DNA的吸收峰在260nm处,蛋白的吸收峰在280nm处,因此可以用OD260/OD280判断DNA纯度,一般认为比值在1.8~2.0之间时,纯度较高

二、主要试剂及材料:

材料:

含有pSK II质粒的大肠杆菌菌株的菌液、含有MP3质粒的大肠杆菌菌株的菌液

试剂:

①细菌的培养:LB培养基、氨苄青霉素

②细菌的裂解与收集:溶液I(Tris-HCl、EDTA、Glucose)、溶液II(NaOH、SDS)、溶液 III(KOAc、CH3COOH)、RNAseA

③质粒DNA的分离与纯化:酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇、70%乙醇、1XTE溶液(Tris-HCl、 EDTA)、东盛生物小提质粒盒

④电泳:琼脂糖、0.5XTBE电泳缓冲液、StarGreen DNA Dye、loading buffer、1XTE buffer

三、实验步骤

①细菌的培养:

将含有pSK II和MP3质粒的大肠杆菌菌液分别于LB培养基上划线 → 37℃过夜培养 → 挑取培养基上的单菌落于液体LB培养基中,震荡培养过夜

②细菌的收集与裂解

- 碱裂解法

吸取1.5ml菌液12000rpm离心1min (沉淀菌体)


弃上清培养液 (完成细菌的收集)


加入150ul溶液I和3ul RNaseA,震荡混匀,静置2min (悬浮菌体、去除RNA)


加入250ul溶液II,轻柔颠倒混匀,放置至清亮(不超过5min。裂解菌体、释放质粒,此步骤动作轻柔,防止基因组DNA断裂,且时间不宜过长)


加入180ul溶液III,颠倒混匀,冰浴10min (中和反应,防止基因组DNA污染)


12000rpm离心5min,吸取上清80ul,重复此操作 (此时已完成了染色体DNA、RNA、细胞碎片、部分 蛋白质的分离)

③质粒DNA的分离

加入53ul的酚/氯仿/异戊醇上下颠倒抽提10min,静置分层 (DNA在水相中),12000rpm 离心10min


通风橱中吸取上清,加入20体积的无水乙醇 (发生核酸-乙醇沉淀)


12000rpm离心5min,倒掉乙醇,短暂离心10s,用移液枪吸取乙醇


加入500ul 70%乙醇洗涤DNA沉淀,离心5min,倒掉乙醇,离心10s,用移液枪吸取乙醇,将其放置在通风橱中促进乙醇挥发


加入300ul 1XTE溶解,65℃热板温育10min

④纯化质粒DNA

加入1XTE使溶液为300ul,加入300ul酚/氯仿,充分震荡抽提5min(去除蛋白)


12000rpm离心5min,吸取上清


加入1/10体积3M NaAc和2倍体积的预冷无水乙醇,混匀


置于-70℃冰箱15min沉淀DNA


4℃12000rpm离心15min,倒掉乙醇,离心10s,用移液枪吸去乙醇


0.5ml 70%乙醇洗DNA沉淀一次,离心2min,倒掉乙醇 (去除DNA中的盐离子)


离心10s,移液枪吸去乙醇,在50-60℃热板上烘干1min


加入20ul 1XTE溶解DNA沉淀,并在65℃热板上温育10min (使DNase失活)

-试剂盒抽提法

前面步骤与碱裂解法相似,参考试剂盒说明书,纯化在纯化柱上进行

加入溶液III离心后的上清液置于DNA纯化柱中,静置2min


12000rpm离心1min,弃滤液 (DNA被吸附到硅胶膜上)


加入500ul溶液PB,12000rpm离心1min,弃滤液 (洗脱蛋白、盐等杂质)


加入500ul溶液W,12000rpm离心1min,弃滤液 (重复此步骤一次,洗掉多余盐离子及乙醇)


12000rpm离心3min (彻底去除纯化柱中残留的液体)


将DNA纯化柱置于新的离心管中,向纯化柱中央处悬空滴加80ul溶液Eluent,室温静置2min (将硅胶吸附柱上的质粒DNA洗脱下来)


12000rpm离心1min (管底即为质粒DNA)

⑤琼脂糖凝胶电泳观察

制胶:

称取1.2g琼脂糖加入盛100ml 0.5XTBE电泳缓冲液的250ml 三角瓶中,摇匀


微波炉加热至琼脂糖溶解(沸腾)


放在冷水中冷却,加入10ul的StarGreen DNA Dye,摇匀


琼脂糖倒入模具中,插上梳子 。凝固后向上垂直拔出梳子,将凝胶转移到电泳槽中,加入0.5XTBE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1mm

点样:

按照碱裂解法纯化前的MP3、pSK II样品各3ul、5ul Marker(10ug/ul、20ug/ul、60ug/ul)、碱裂解法纯化后的MP3、pSK II样品各6ul,试剂盒提取的MP3、pSK II样品各2ul的顺序依次加入点样板小孔中,再分别加入10Xloading buffer,配置10ul点样体系,吹吸混匀

电泳:

打开电源开关,调节电压3-5V/cm

观察:

将电泳好的凝胶置于凝胶成像仪中观察

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