2021-07-24 神奇的单链DNA合成技术(4)——外切酶富集

        PCR扩增是获得一段DNA的最有效也是最快速的方法，但是PCR的产物一般是双链DNA。如果只想要其中一条链，我们除了采用不对称PCR和生物素标记纯化的策略外，可能最容易想到的是能不能通过酶降解倒那条不需要的。

        答案是肯定的，使用Lambda和Exo III核酸外切酶就可以实现。Lambda核酸外切酶 作用于双链DNA，沿 5´→3´方向逐步切去5´单核苷酸。最适底物是5´磷酸化的双链 DNA，也能缓慢降解单链DNA和非磷酸化底物。该酶不能从DNA 的切刻或缺口处起始消化。ExonucleaseIII（核酸外切酶III）具有以下4种催化活性：(1)3’→5’外切脱氧核糖核酸酶活性，尤其适合双链：ExonucleaseIII（核酸外切酶III）降解dsDNA的平末端、5’-突出末端或切口，从DNA链的3’-端释放5’-单磷酸核苷酸，产生单链DNA片段。该酶对具有3’-突出末端(至少有4个碱基，且具有3’-末端C残基)的DNA(1)、单链DNA、硫代磷酸酯连接的核苷酸无活性。

        因此，如果只想获取PCR产物中的正链（图1左），在进行PCR时，使用一条5'端为OH的正向引物和5'端进行磷酸化修饰的反向引物。该PCR产物使用Lambda和Exo III核酸外切酶处理后即可将5'端带磷酸化修饰的链降解掉，剩下的就是需要的ssDNA。针对负链ssDNA的纯化则只需要将PCR产物改为一条5'端进行磷酸化修饰的正向引物和5'端为OH的反向引物。

图1 外切酶富集ssDNA