零基础入门转录组分析——第五章（表达定量）

零基础入门转录组分析——第五章（表达定量）

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（我这里使用的虚拟机是vmwarewokstation，版本16.0.0， linux系统是ubantu64位，版本20.04.3）

上一章我们做了序列比对，并对原始的XXX.sam文件进行压缩，获得XXX.bam文件。

本实验选用的是模式生物——C57BL/6J小鼠。

实验分组：药物处理组，对照组，每组6只鼠。

软件：subread中的featureCounts（如果没有安装，可以参考之前章节[零基础入门转录组分析——第一章（软件的安装）](https://blog.csdn.net/weixin_49878699/article/details/128787068)）

1. 序列比对结果的复查

在前三章中，分别做了原始数据的准备和质控，质量过滤以及序列比对。

首先来看一下现有的文件和之前的输出结果如下图所示：（质控的结果我给删了，有点占地方）

• 00_raw_data文件夹中是我们的原始数据和样本信息表，但是有了clean_data这些就用不到了。
• 01_ref文件夹中有参考基因组（XXX.fa）和注释文件（XXX.gtf）以及上一章我们构建好的参考基因组索引文件（XXX.ht2）
• 02_clean_data文件夹中有之前做完质量过滤的数据（又叫做clean data）。
• 03_hisat2_result文件夹中有上一章做完的序列比对结果文件：A2.bam和A2.log

在这一章中我们会用到的文件有：
01_ref文件夹中的参考基因组注释文件（XXX.gtf）
03_hisat2_result文件夹中的序列比对结果：A2.bam文件

会用到的软件是：subread中的featureCounts，可通过指令：which featureCounts查看是否安装成功。如下图，表示安装成功。

通过指令：mkdir 04_quantify_result创建一个名为04_quantify_result的文件夹，可以后续用来存放结果文件

2. 表达定量

（1）检查00_ref文件夹中是否有XXX.gtf文件
（2）检查03_hisat2_result文件夹中是否有XXX.bam文件
（3）which featureCounts指令检查是否有featureCounts软件
如果上述三个都满足，接下来就可以开始定量了，如果任何一个不满足，可以翻看专栏下前几章内容

首先介绍几个我们会用到的featureCounts软件的常见参数：

• -T 表示线程数，线程数越多，运行速度越快，可以通过htop指令查看，如下图，我是四个处理器，所以最多只能设置四个

• -a 输入的参考基因组注释文件路径

• -p 是在双端测序的情况下使用，会统计fragment而不是read

• -countReadPairs 计数的是(fragments)而不是read，此选项仅适用于双端测序read

• -g 提供参考基因组注释文件中的一个id（这里我不太理解，但一般选默认gene_id即可）

• **-t ** 指定定量的类型，默认是exon（外显子），这就是说当read落到外显子上才会被统计

• -M 多重read会被统计

• -O 允许多重比对，就是说当一个read比对到多个外显子时，这条read会被统计多次

• -o 定量结果输出目录及文件名

其他的参数可以通过featureCounts -help查看，在此不过多描述！

表达定量：通过指令featureCounts -a /home/daizhuer/Desktop/01_ref/Mus_musculus.GRCm39.108.gtf -T 3 -p --countReadPairs -g gene_id -t exon -M -O -o /home/daizhuer/Desktop/04_quantify/A2 /home/daizhuer/Desktop/03_hisat2_result/A2.bam

如下图所示，表明featureCounts正常运行，并且图中显示有90.6%的reads定量到了基因的外显子上

我们可以看到04_quantify文件夹下生成两个文件，一个是定量的结果A2，另一个是表达定量输出的结果报告A2.summary

如果想查看定量结果报告，可以通过less -S A2.summary查看报告，就可以看到那些没有分配上的reads是出于什么原因，这每一行在此不详述了，可以自行搜索昂。

除了这个结果报告，最重要的就是定量结果：A2文件，同样可以通过less -S A2查看，如下图：

• Geneid 是基因id（重点关注）
• Chr 是该基因位于哪条染色体上
• Start 表示该基因起始位置
• End 表示该基因结束位置
• Strand 我不太懂是啥，不管！！！
• Length 基因长度，后面计算RPKM和TPM会用到（重点关注）
• 最后一列就是定量的结果（就是定量到该基因上的reads有多少条）（重点关注）

除了上述我标注的重点关注的地方，其他几个用不到，可以不关注！

3. 提取有效信息

前面我们看到A2文件中一共有7列，实际能用到的也就3列，而且这仅仅是A2一个样本的定量信息，多个样本就有多个这样的文件，所以要对文件进行处理。

通过指令cat A2 | cut -f 1,7 > A2.count可以将A2文件中的第一列和第7列切出来，并输出到A2.count文件中

通过less -S A2.count指令可以查看结果，如下图所示：

第一列是基因id，第二列就是定量到该基因上reads的数量（也就是所谓的基因表达量）。

4. 合并多个样本定量结果

通过cut指令我们得到多个修改后样本的定量结果（XXX.count），每个XXX.count都跟上图长得一样，有一列基因id，有一列定量结果，接下来要将多个样本的定量结果合并成矩阵。

我以两个样本数据作为演示（A3是复制的A2，只不过名字改成A3了）

首先我们看到当前文件夹目录下有两个.count文件

通过paste A2.count A3.count > hebing指令将两个count文件合并并输出为一个名为hebing的文件，通过less -S hebing指令可以查看结果，如下图所示：

前两列是A2.count中的内容，后两列是A3.count中的内容，多个样本可以效仿刚才的指令合并到一起。

但是实际中第一列的信息其实都一摸一样的，这就意味着我们只需要第一列的基因id和每个样本的基因表达量，那么就要提取有用的列！！！

通过指令cat hebing | cut -f 1,2,4 > raw_count就能提取hebing文件中1，2，4列，并输出结果到一个名为raw_count文件中，通过less -S raw_count命令查看，结果如下图所示：

第一列是基因id，第二列是A2的基因表达量，第三列是A3的基因表达量。（如果是多个样本，可以效仿上述的命令，一定要理解才能灵活使用！！！）

5. 进一步修改基因表达矩阵

切换到linux的文件管理器下，打开04_quantify文件夹，将我们修改后的raw_count文件直接拖到宿主中。

在宿主机中找到刚才拖拽过来的raw_count文件，只接用记事本打开，修改成如下图所示的样子，就可以保存退出。

如果想用批量处理的方式自动操作，可以参考前几章的内容，在此不再反复重复了！

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注：featureCounts定量结果是原始数据也就是常说的raw_count，后续还需要经过TPM和FPKM换算对数据进行标准化。

以上就是表达定量的所有过程，如果有什么需要补充或不懂的地方，大家可以私聊我或者在下方评论。

如果觉得本教程对你有所帮助，多多点赞加关注昂，下期再见！！！

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同时浅述一下后续会更新的内容：（后续将会在Rstudio下进行）

• 差异表达分析和原始数据标准化（TPM和FPKM）
• 可视化之ggplot2绘制火山图
• 可视化之pheatmap绘制热图
• GO和KEGG富集分析及ggplot2绘制柱状图