转录组入门学习（五）

表达定量

1. 处理原始比对文件

• 利用 picard / samtools
• 将 sam 格式转换为 bam 格式
• 对 bam 文件进行排序
• 去除比对得分较低的序列
• 如果需要，可以去除重复 reads

2. STAR + RSEM （先比对，再定量，耗时长）

• 输出结果可以选择转录本定量或者基因定量
• 定量单位包括 feature count, FPKM, TPM
• 操作相对复杂

3. STAR + HTSeq （先比对，再定量，耗时长）

• 输出结果为原始 read count
• 结果可用于差异表达分析
• 操作相对简单

#htseq-count
htseq-count -r pos -m union -f bam -s no \
-q 03align_out/sample2Aligned.sortedByCoord.out.bam > 05htseq_out/sample2.htseq.out

4. Kallisto (free-alignment) （只定量，不比对）

• 速度快，省内存
• 基于转录本定量
• 不产生 bam 文件，不方便其他后续分析

5. STAR + RSEM 实例演示

• 准备定量分析所需文件

# rsem prepare reference：建立参照基因组
rsem-prepare-reference --gtf 00ref/Araport11_GFF3_genes_transposons.201606.gtf \
00ref/TAIR10_Chr.all.fasta \
arab_RSEM/arab_rsem

• 利用STAR结果进行分析定量

rsem-calculate-expression --paired-end --no-bam-output \
--alignments -p 5 \
-q 03align_out/sample2Aligned.toTranscriptome.out.bam \
arab_RSEM/arab_rsem \
04rsem_out/sample2_rsem

6. Kallisto 演示

• 利用转录本参考序列文件构建索引

mkdir arab_kallisto
cd arab_kallisto
kallisto index -i arab_kallisto ../arab_RSEM/arab_rsem.transcripts.fa 

kallisto运行结果：产生了54.4 million 个k-mer

• 进行无比对定量分析

#定量：quant: 定量模式；-i：index文件；-o：输出文件
kallisto quant -i arab_kallisto/arab_kallisto -o 05kallisto_out/sample2 \
02clean_data/sample2_paired_clean_R1.fastq.gz 02clean_data/sample2_paired_clean_R2.fastq.gz  #输入文件，即原始数据，不需bam格式

运行结果