一文看懂病原微生物检测（上篇）

作者：biofan
审稿：童蒙
编辑：amethyst

科学家曾一度以为，人体是一座自给自足的小岛

• 我们能感受自身的信号并及时调控行为。例如：饿了渴了，吃顿好的；冷了热了，更换衣物。
• 我们的身体能分泌消化酶消化食物，我们的免疫细胞能识别危险的病原体，并及时进入战斗状态。

然而，科学家逐渐发现，人体并不是一座孤立的小岛，而是一个庞大的生态系统。在这个系统里，有着我们的“土著民”——大概50万亿细胞，也有着体型较小的“移民者”——大概500万亿微生物，足足是我们的土著民细胞的10倍之多。

他们聚居在我们的皮肤，生殖器，口腔以及肠道。这些“移民者” 人龙混杂，既有能帮助身体进行消化、生长和防御，对人体“社会”的有贡献的菌落，也有一些危害“公共安全”的病原微生物。然而，有害和有益的概念也并非非黑即白，更多的是需要特定的情境。

而在近年来，造成人类感染的病原微生物日益复杂，种类增多，这些”外来入侵者“已造成严重的公共恐慌和经济损失。成为全球关注的焦点。常见的病原微生物包括 病毒（virus），细菌（bacteria），真菌（fungi）以及寄生虫（protozoa）。

人类历史的几次浩劫也与之息息相关，比如当前的新冠病毒导致的肺炎肆虐全球。历史上由鼠疫杆菌传播导致的鼠疫大流行使得欧洲人口锐减。而由疟原虫传播的疟疾，直到今天还是热带地区主要传染病之一。

除了重大公共卫生事件，感染是临床上危重病人死亡的主要原因，比如说脓毒症的死亡率高达50%，因此快速诊断病原体，对症用药，是核心。传统的检测方法在敏感性，特异性以及失效性存在局限。

新一代测序技术（mNGS）不依赖传统微生物培养，直接高通量测序，快速识别样本的病原微生物，尤其适用于急危重症和疑难感染的诊断，而这一点已达成了专家共识，具体可以参见2019年中华急诊杂志发表的《宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共识》。

其大致流程如下图。主要分为：

• 样品采集
• 实验建库和测序
• 信息分析流程

样品采集要求

在《宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共识》里，针对实验方面的样本收集以及具体规范严格的操作都有清晰的说明，需要大家仔细阅读，比如样本采集注意事项：

• 严格无菌操作 : 采集无菌标本时应注意对局部及周围皮肤的消毒。

• 无菌部位的标本具有更高的临床价值，采集过程应尽可能的减少“有菌部位正常菌群导致标本的 污染”。

• 标本的种类。原则上，送检感染部位的体液或者组织标本敏感性、特异性和可信度更高。比如对于重症肺部感染患者，痰液 / 肺泡 灌洗液和血液标本检测病原体的一致性仅仅为 40%~50%。

而病原微生物检测主要样本组织采集类型如下：

其中采集采集中有一些注意操作事项 比如静脉血，采集后要轻轻颠倒混匀，避免凝固，但动作不要太过激烈，防止溶血，痰液的话，要用清水漱口2-3次，用力咳出肺部深处痰液放入无菌杯中......

实验建库测序

样本采集之后就是实验建库和测序的部分了（如下图左）：

由于采集到的样本本身大多含有致病性病原菌，需要及时灭活处理，提取核酸并定量。文库制备流程如上图，如果提取的是RNA需要反转录成DNA文库，之后再进行文库构建包括DNA 打 断、接头连接、PCR 扩增等过程，检测文库质量合格上机测序。注意每次实验都应包括内参、阴性和阳性对照来达到质控的效果。

信息分析流程

一般而言，mNGS的成功除了严格的实验条件之外呢，还需要严格的信息分析的流程。基本步骤如下：
1.数据质控
2.去除人基因组
3.与数据库比对，鉴定病原微生物
4.生成报告

参考文献

1.IDseq—An open source cloud-based pipeline and analysis service for metagenomic pathogen detection and monitoring
2.A cloud-compatible bioinformatics pipeline for ultrarapid pathogen identification from next-generation sequencing of clinical samples
3.Improved metagenomic analysis with Kraken 2
4.宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共识

请大家继续关注我们下一篇的介绍，我们会对生信分析流程进行详细的介绍。下期再会啦~~