Cell丨新抗原驱动的 B 细胞和 CD4 T 滤泡辅助细胞协同促进抗肿瘤 CD8 T 细胞反应
原创 珍奇 图灵基因 2021-12-18 20:23
收录于话题#前沿分子生物学机制
撰文：珍奇
IF：41.582
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亮点：
本研究发现TFH 和 GC B 细胞的富集与 LUAD 的良好临床结果相关；B 细胞识别的新抗原驱动肿瘤特异性 B 细胞和 TFH 细胞反应；肿瘤特异性 TFH 细胞可产生 IL-21；且IL-21 对肿瘤控制和肿瘤浸润 CD8 T 细胞效应功能至关重要。
CD4 T 滤泡辅助 (TFH) 细胞对与生发中心 (GC) 形成相关的 B 细胞具有支持作用，但TFH-B 细胞相互作用在癌症中的重要性尚不清楚。2021年11月30日，耶鲁大学Nikhil Joshi团队在《Cell》杂志上发表了一篇名为“Neoantigen-driven B cell and CD4 T follicular helper cell collaboration promotes anti-tumor CD8 T cell responses”的文章。他们发现 TFH 细胞转录特征的富集与 GC B 细胞特征相关，并且与肺腺癌 (LUAD) 患者的生存期延长相关。通过开发了一种LUAD 小鼠模型，他们发现肿瘤特异性 TFH 和 GC B 细胞以及主要由 TFH 细胞产生的白细胞介素 (IL)-21 之间的相互作用对于肿瘤控制和效应 CD8 T 细胞功能是必要的。肿瘤新抗原可以通过促进它们与肿瘤特异性 B 细胞的相互作用来调节肿瘤特异性 CD4 T 细胞的命运，反之又通过增强 CD8 T 细胞效应功能来促进抗肿瘤免疫。
为了研究 GC B 细胞和 TFH 细胞在人类 LUAD 中的潜在重要性，研究者首先使用CIBERSORT 和 LM22 参考单细胞基因表达谱矩阵，发现了髓细胞群和 CD8 T 细胞等几种免疫细胞类型的富集。其中，数据表明 TFH 和 GC B 细胞在人 LUAD 肿瘤组织中富集。为了检查 GC B 细胞和 TFH 细胞是否与 LUAD 个体的临床结果相关，他们建立了 LUAD GC B 细胞和 TFH 细胞的基因表达特征。对来自 TCGA 的 478 例 LUAD 病例的分析表明，LUAD 个体的总生存期延长与 GC B 细胞或 TFH 特征之间存在显着相关性。此外，他们还确定了 GC B 细胞和 TFH 特征之间的显着相关性，这表明这两种细胞类型在肿瘤中共存。 GC B 细胞和 TFH 特征也与 Th1 和 CD8 效应 T 细胞特征相关。总之，这些数据表明 GC B 细胞和 TFH 细胞存在于人类肺癌中，并有助于抗肿瘤免疫反应。
随后，研究者建立了“NINJA”模型，NINJA 系统可用于对表达新抗原的 KP 肺肿瘤进行编程。为了促进对肿瘤特异性 T 细胞和 B 细胞反应的研究，他们创建了 HEL、LCMV GP33-43/FLAG/GP61-80、T2A 和密码子优化的 mScarlet 的融合蛋白。这种底物被称为 HELLO 并产生两种多肽：HEL-GP33-43/FLAG/GP61-80 和 mScarlet 的新抗原融合物，mScarlet 是一种用于区分表达新抗原的肿瘤细胞的亮红色荧光蛋白。他们使用 HELLO 编码慢病毒载体转导 KP 肿瘤细胞系， HELLO 是唯一的蛋白质产物，可通过荧光激活细胞分选 (FACS) 分选 mScarlet 阳性 KP-HELLO 肿瘤细胞。在新抗原融合HEL-GP33-43/FLAG/GP61-80 之前他们在 HELLO 构建体中放置了一个信号肽序列，这样它就会被 KP-HELLO 细胞分泌，而 mScarlet 蛋白将保留在细胞质中。为了验证这一点，他们分离了 HEL 特异性 MD4 B 细胞或未富含 HEL 特异性 BCR（阴性对照）的多克隆 B6 B 细胞，并添加了 HEL 蛋白（阳性对照）、KP 或 KP-HELLO上清液进入每个条件。培养 48 小时后，流式细胞术分析显示 MD4 B 细胞活化，基于 CD86 中值荧光强度 (MFI) 的显着增加，在 MD4 细胞与 KP-HELLO 上清液或 HEL 蛋白孵育的样品中。48 小时后，含有 GP61-80 的样品中 CD44hi CD69hi（激活的）CD4 T 细胞显着增加，表明 B6 和 MD4 B 细胞能够将 GP61-80 呈递给 SMARTA CD4 T 细胞。
为了评估将 HELLO 新抗原引入 KP 肿瘤是否在体内引发 TFH 细胞反应，他们KP-HELLO 肿瘤细胞植入 B6 小鼠，并使用流式细胞术分析 dLN 中的内源性 CD4 T 细胞。在第 10-12 天，CD44hi PSGL1lo 多克隆 CD4 T 细胞的频率总体增加了 1.3 倍（KP-HELLO 与 KP），而这些进一步上调 PD-1 和 CXCR5 的 PSGL1lo 细胞的频率增加了 4 倍，导致 TFH 细胞频率显着增加。他们又将 KP-NINJA 或 KP-HELLO 肿瘤植入 Il4GFP 小鼠并分析 GP66 特异性 CD4 T 细胞的 TFH 标志物表达。图中数据表明，KP-HELLO 肿瘤中含有 B 细胞的新抗原，且足以引发肿瘤特异性 TFH 和 GC B 细胞反应。
与 B6 小鼠相比，KP-HELLO 肿瘤在免疫缺陷 RAG1 敲除（KO）小鼠中显示出增加的生长速率。CD4 T 细胞、TFH 细胞和 B 细胞对于最佳控制 KP-HELLO 肿瘤生长至关重要。相比之下，KP-NINJA 肿瘤生长在 B6 与 uMT 宿主中没有显着差异，B 细胞和TFH 细胞是减少 KP-HELLO 肿瘤生长所必需的。TFH 和 B 细胞仍可能以非抗原驱动的方式起作用以促进抗肿瘤免疫反应。为了正式测试肿瘤特异性 B 细胞是否足以控制 KP-HELLO 肿瘤，他们通过在 KP 之前将初始肿瘤特异性 SWHEL 或多克隆野生型 (WT) B6 B 细胞过继转移到 uMT 受体中进行了拯救实验-HELLO 肿瘤开始。只有 SWHEL B细胞的过继转移才能使 uMT 小鼠的肿瘤控制恢复到在对照小鼠中观察到的水平。CD44hi PSGL1hi 上的淋巴细胞抗原 6C (Ly6C) 表达已被广泛用于区分 TH1 和TFH 细胞，因为 Ly6C 受 TH1 特异性转录因子 T-bet 的调节。与转移的 SMARTA CD4 T 细胞相比，CD4-Cre Bcl6fl/fl 小鼠的内源性 GP66 特异性 T 细胞的 PSGL1hi Ly6Clo 和 PSGL1hi Ly6Chi TH1 样细胞的频率增加，后者表达更高量的 T-bet比它们的 TFH 对应物。
由于WT 小鼠与 B 或 T 细胞缺陷小鼠之间的肿瘤生长差异在肿瘤植入后相对较早的时间点就变得明显，因此他们进一步讨论 CD8 T 细胞是否受到 B 和 T 细胞缺乏的影响。首先，他们通过检查抗 CD8a 抗体耗竭的 B6 小鼠的 KP-HELLO 肿瘤生长，发现了CD8 T 细胞耗竭是有效的，并导致小鼠的肿瘤控制受损。他们接下来发现，在携带 KP-HELLO 肿瘤的 WT 小鼠中，40% 的肿瘤浸润 CD8 T 细胞是颗粒酶 Bhi，与效应表型一致。与此一致，大多数这些颗粒酶 Bhi 细胞表达 PD-1。相比之下，TFH 缺陷小鼠的肿瘤浸润 PD-1hi 颗粒酶 Bhi CD8 T 细胞的频率和数量显着减少，uMT 小鼠中肿瘤浸润的 PD-1hi 颗粒酶 Bhi CD8 T 细胞的频率和数量显着减少。关键的是，B 细胞缺乏不会影响 KP-NINJA 肿瘤中肿瘤浸润 CD8 T 细胞的颗粒酶 B 表达。这些数据表明 B 细胞抗原可以通过 TFH 细胞和 B 细胞依赖性机制驱动效应 CD8 T 细胞反应。
接下来他们研究了 TFH 和 B 细胞如何促进肿瘤浸润 CD8 T 细胞的效应子功能的机制。首先，他们推断这可能是通过 IL-21（TFH 细胞的标志性细胞因）可以驱动 CD8 T 细胞的效应子功能。结果显示，IL-21 表达仅在 KP-HELLO 肿瘤小鼠中检测到，KP 肿瘤未检测到，表明 IL-21 表达需要 HELLO 新抗原的存在。超过 95% 的 IL-21 表达细胞是 CD4 T 细胞，其中 85% 是 PSGL1lo，70% 是表达成熟 TFH 细胞标记物。他们接下来观察到IL-21 表达需要 B 细胞识别的新抗原，因为 KP-NINJA 肿瘤表现出 IL-21表达 GP66 特异性 CD44hi CD4 T 细胞的频率降低了 70%、。因此，肿瘤对 TFH 细胞中 IL-21 的诱导和/或维持需要 B 细胞和 B 细胞识别的新抗原。IL-21 受体 (IL21R)在肿瘤和 dLN 中的 CD44hi PD1hi 效应子 CD8 T 细胞上表达。他们的发现与其他数据一致，表明 IL-21 作用于 CD8 T 细胞以驱动效应器功能，并证实了 IL-21 在增强KP-HELLO 肿瘤中的抗肿瘤 CD8 T 细胞反应中的关键作用。
为了阻断 TFH、B 细胞、IL-21 信号和效应 CD8 T 细胞反应之间的循环，他们首先评估了 T 细胞-B 细胞相互作用是否是抗肿瘤免疫所必需的。在 T 依赖性免疫反应中，由于T 细胞和 B 细胞相互帮助的能力存在缺陷，CD40/CD40L 缺陷和 ICOS/ICOSL 缺陷小鼠无法形成 GC B 细胞或成熟的 TFH 细胞。ICOS 和 CD40L 的缺陷导致 KP-HELLO肿瘤的更快生长，与在 uMT 小鼠中观察到的变化相同。ICOS 缺陷可能影响许多细胞类型，但将 WT SMARTA T 细胞过继转移到 ICOS 缺陷宿主中拯救了 KP-HELLO 肿瘤控制，而 OT-II T 细胞的转移则没有。
接下来，他们评估了 SMARTA T 细胞拯救对 TFH 缺陷小鼠中 B 细胞和 CD8 T 细胞的影响。他们使用流式细胞术来分析缺乏 B 细胞（B6 与 uMT）或 B 细胞-识别新抗原（KP-HELLO 与 KP-NINJA）的荷瘤小鼠，其中肿瘤特异性 TFH 细胞反应明显受损，PSGL1lo Ly6Clo 细胞也显着减少。为了评估 T 细胞-B 细胞相互作用对 TFH 分化过程的影响，他们分析了 B6 与 uMT 或 KP-HELLO 中 CD4 T 细胞分化不同阶段的Bcl-6 和 IL-21 表达。他们发现，在没有 TFH-B 细胞相互作用的情况下，Bcl-6 和 IL-21 的表达在每个阶段都会受到影响。TFH 缺陷小鼠肿瘤浸润 CD8 T 细胞中 PD-1hi 颗粒酶 Bhi 的显着降低通过 SMARTA T 细胞转移而恢复到 WT 水平，但不是通过 OT-II T 细胞转移。因此，肿瘤特异性 TFH 细胞的存在足以驱动肿瘤浸润 CD8 T 细胞中的效应子功能。
教授介绍：
Nikhil Joshi，耶鲁大学医学院助理教授。Joshi实验室使用复杂的肿瘤模型和先进的方法来研究免疫细胞与发展中肿瘤的相互作用。目标是从机械上确定为什么这些相互作用不会导致更有效的抗肿瘤反应，并确定通过遗传操作和治疗干预调节这些相互作用的切入点。其研究重点是使用已建立的复杂小鼠模型来研究T细胞亚型如何在肿瘤微环境中发挥作用，以及它们与其他免疫细胞类型的相互作用如何影响肿瘤发育。他们实验室结合了小鼠的先进遗传建模和免疫学技术，以解决肿瘤免疫学的基本问题。
参考文献：
Cui C, Wang J, Fagerberg E, et al.Neoantigen-driven B cell and CD4 T follicular helper cell collaborationpromotes anti-tumor CD8 T cell responses [published online ahead of print, 2021Nov 22]. Cell. 2021;S0092-8674(21)01322-2. doi:10.1016/j.cell.2021.11.007