2022-06-17

                                                 第一课：ROCK 抑制剂和基底细胞共同诱导表皮细胞的条件性重编程

一、条件性重编程系统能够成功扩增多种原代细胞和原位肿瘤细胞

作者通过使用Swiss 3T3 J2 细胞和Y-27632抑制剂经过条件性重编程(图1A)的流程培养正常的前列腺，乳腺，气管细胞和肝癌细胞，发现这些细胞能够在这种条件下进行快速增殖，并在5天细胞长满培养皿。并且这些细胞能够在与基底细胞接触地方形成类似表皮的边界。

条件性重编程培养系统需要基底细胞和Rho相关激酶抑制剂Y-27632。通过对前列腺细胞和乳腺细胞的培养发现：当只有抑制剂时，细胞获得非常有限的增殖，且与单独培养基组无太大差异;当基底细胞的存在时，前列腺和乳腺细胞获得相对较好的增殖，但是增殖也是受限的；同时存在基底细胞和抑制剂时，细胞能够获得快速、不受限制的增长(图1B)。

二、对后期乳腺和前列腺细胞的鉴定

将体外条件性重编程培养的乳腺和前列腺细胞转移至角质形成细胞的培养基中培养时，正常乳腺细胞和前列腺细胞能够分化形成前列腺球和乳腺细胞球，然而通过表达Myc T58A和hTERT的乳腺癌细胞则形成实体的球形细胞团(图2A)。

作者之前的研究表明，基底细胞能够诱导端粒酶逆转录酶(hTERT)的表达。通过对前列腺细胞中的mRNA进行定量分析发现，加入基底细胞后hTERT的表达量显著上升。在加入抑制剂后，hTERT的表达量呈增强的趋势(图2B)。乳腺和前列腺细胞中hTERT的诱导程度相似，在细胞培养的早期被迅速诱导表达(图2C)。因为现有的永生化细胞的方案会导致细胞基因组的改变。因此，作者通过对染色体进行分析和DNA足迹进行分析发现条件性重编程细胞均未见异常(图2D和E)。

三、建立的癌变和正常前列腺细胞的培养

为了能够为基因组学、生物化学以及药物筛选提供相互匹配的正常细胞和癌变细胞的培养。作者把同一个病人体内的正常的前列腺组织细胞和恶性癌变的腺体组织细胞进行条件性重编程培养。在条件性重编程培养的情况下(2D培养)，正常组织细胞和癌变细胞并没有明显差异(图3)。但是当细胞转移至角质生成细胞培养基(Matrigel)中培养时(3D培养)，正常前列腺细胞形成规则的腺体球形细胞，而癌变的细胞则形成不规则的细胞团。并且当把这两类培养的细胞免疫缺陷的小鼠皮下时，条件性重编程培养的癌变细胞能够有效的发展成为肿瘤，而培养的正常的前列腺体细胞则不会发展成为肿瘤(图3)。

四、人的原代细胞克隆形成效率

作者将获得人的原代角质生成细胞和宫颈癌细胞进行条件性重编程培养7-10天，最后通过利用结晶紫对活细胞克隆进行鉴定，发现人的原代细胞形成效率在40%-70%左右。

总结与讨论

关于条件性重编程培养的机理尚未有明确的研究。但是，通过对以往研究的总结和类比，作者认为条件性重编程直接改变细胞的生长，而非筛选出一小部分具有干细胞特性的细胞。人的乳头瘤病毒诱导细胞的永生化需要两个重要蛋白的参与，E6和E7。其中E6能够诱导诱导端粒酶逆转录酶(hTERT)的高表达;另一个E7能够抑制Rb信号通路的激活。与之类似，第一，作者在图2B中证明F培养基和基底细胞能够有效诱导hTERT的表达(图5左侧);第二，在条件性重编程培养中，作者使用了Rho相关激酶抑制剂Y-27632，其能够调节细胞骨架蛋白的信号通路从而促进细胞增殖，另外也能通过抑制p16/Rb信号通路从而促进细胞增殖(图5右侧)。

作者通过基底细胞和抑制剂而非引入外源基因而实现了细胞的体外扩增;并能够保持细胞的正常特性而非像hTERT永生化的细胞形成无规则的细胞团;能够提供用之不竭的病人特异性的细胞用于基因或小分子筛选。