真菌菌丝中总RNA的提取----TRNzol Universal总RNA提取试剂

原理概述：
RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，灭活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，可通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、完整的总RNA。
真核细胞中含有多种RNA，如rRNA、mRNA、tRNA及一些小分子RNA。RNA以rRNA的数量最多，占80%-85%，tRNA及核内小分子 RNA10%-15%，而mRNA分子占1%-5%。

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核酸提取原则：
⑴ 保证核酸的完整性；
⑵ 获得高纯度的核酸；
⑶ 操作简便，稳定性强。

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图片来自TIANGEN-mRNA.png

一、利用TRNzol Universal总RNA提取试剂

TRNzol Universal 是在TRNzol 基础上研发的含有指示剂的总RNA 提取试剂。该产品具有更强的裂解能力，更高的灵敏度，可从病毒、细菌、真菌、动物和植物细胞、组织、体液等样本中提取总RNA 的试剂。TRNzol Universal 能够充分裂解样本、溶解细胞内含物，并有效抑制RNase 活性，提取样本中的总RNA，同时保证了提取过程中RNA 的完整性。该试剂对样本起始量无限制，一个小时内即可完成反应。

TRNzol Universal试剂.jpg

1. 自备试剂
   氯仿、异丙醇、无菌水、75%乙醇（用无菌水配制）

2. Prepare
   1.5ml离心管、计时器、液氮、研钵、镊子、涡旋振荡器、低温离心机、超微量分光光度计

3. 注意事项：
   

   
   
   图片来自TIANGEN官网.png

4. Steps

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⑴ 取0.1g新鲜菌丝于液氮中快速研磨成粉末，转入1.5mL灭菌冷冻离心管中；
⑵ 涡旋混匀，室温静置5min；
⑶ 加入200μl氯仿，剧烈振荡15sec，室温放置3min；
⑷ 4℃ 12,000rpm离心15 min。样品会分成三层：粉色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相约500 μl转移至新的1.5mL离心管中；

离心后出现分层.jpg

⑸ 在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置10 min；
⑹ 4℃ 12,000 rpm离心10 min，去上清。离心前RNA沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀；
⑺ 加入1 ml 75%乙醇洗涤沉淀；
⑻ 4℃ 10,000 rpm 离心2min，倒出液体，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出；
⑼ 室温放置3min晾干沉淀；
⑽ 加入30-50μl RNase-Free ddH₂O，反复吹打、混匀，充分溶解RNA（冰上进行）。

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Min point ：
异硫氰酸胍裂解细胞，使得RNase失活；同时使得核酸蛋白复合物分离，将RNA释放到溶液中；
酸性酚-氯仿抽提，低pH值的酚使RNA进入水相，蛋白和DNA留在有机相
苯酚和脂类溶于有机溶剂氯仿中形成有机相；由于氯仿密度较大，使得有机相位于下层，而水相在上层
异丙醇：沉淀RNA
乙醇：沉淀RNA、除小分子、清除多余的有机溶剂
测定OD₂₆₀/₂₈₀=1.9~2.1

图片来自TIANGEN官网.png

RNA溶于上层的水相.png

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Total RNA.png