如何高效去除质粒中的内毒素污染

操作步骤： (请根据需要自备异丙醇、乙醇、50mL 离心管、20mL 离心管或 15mL 离心管)

1. 取出洗涤液，按终浓度 70%比例加入无水乙醇，如每 3mL 洗涤液加入 7mL 无水乙醇，每 6mL 洗涤液加入 14mL 无水乙醇，充分混匀。

2. 取 30mL 菌液，置于 50mL 离心管中，4000rpm 离心 5 min，彻底弃除上清。

3. 加入 5ml 溶液 A，充分振荡 2 分钟，使菌体充分悬浮，确保无絮块存在，转移到 15mL 离心管。4000rpm 离心 5min，彻底弃除上清。

4. 加入 1ml 溶液 I 和 50ul 溶液 B，充分振荡 2 分钟，使菌体充分悬浮，确保无絮块存在。

5. 加入 2ml 溶液 II，盖紧管盖，轻轻颠倒混匀 6 次，注意整个管子的内表面均需与溶液 II 接触，室温放置至溶液清亮。（一般为 4-5min，如5min 后溶液未变清亮，说明细菌过多，应考虑减少菌液量。注意混匀手法要温和，不要剧烈混合。溶液 II 取液后应尽快旋紧管盖。）

6. 加入 1.5ml 溶液 III，盖紧管盖，立即轻轻颠倒混匀 8 次，4℃放置 5min。（此步注意要尽快混匀，但手法要温和）

7. 4℃、10000rpm 离心 15min，小心吸出上清，轻移至新的 15ml 离心管。（应在离心机自动停转后取出离心管，以免沉淀悬浮）

8. 加入 2.5ml 异丙醇，充分混匀。将富集吸附柱放在抽滤装置上，再将 10mL 无菌注射器针筒插入富集吸附柱上端，将上述溶液转入针筒内，真空抽滤至富集吸附柱内液体刚刚抽滤完毕（约 2-10 分钟，注意不要抽滤太干，太干不利于后续步骤开展）。

9. 向针筒内加 2mL 洗涤液，静置 2 分钟，真空抽滤至富集吸附柱内液体刚刚抽滤完毕（约 1-5 分钟，注意不要抽滤太干）。

10. 向针筒内加 1mL 洗涤液，抽滤 2 分钟。同时，按每份样本 20μL 取洗脱液（如 10 份提取样本，即取 200μL 洗脱液），放置于灭菌 1.5mL离心管，65℃预热。

11. 将富集吸附柱放入收集管内，12,000 rpm 离心 3 分钟，离去残留的洗涤液。

12. 取出富集吸附柱，放入新的 1.5mL 灭菌离心管内，加入 20 μL 预热洗脱液，静置 2 分钟，12,000 rpm 离心 2 分钟，收集 DNA 溶液。

注意事项：

1、  单只富集吸附柱质粒负载量在 60ug 左右，提取的菌液量应根据所含质粒量进行选择，如预估 1mL 菌液可提质粒 2ug，则单个提取套装提取菌液不要超过 30mL，如菌液较多，可分 2 管或多管进行。

2、  溶液 II 取液后应尽快旋紧管盖，密封避光保存。溶液 II、溶液 III 如出现结晶或者沉淀，可在 37℃水浴中加热几分钟溶解。

3、  提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。 如所提质粒为低拷贝质粒或者大于 10kb 的大质粒，应加大菌体使用量，按比例增加溶液 I、溶液 B、溶液 II、溶液 III、异丙醇等的用量。

4、  所用洗脱液的最小体积为 10 μL，可根据所提质粒的预估量和期望达到的质粒浓度选择合适的洗脱液用量，如预估提取的质粒量为 40ug，期望的质粒浓度为 2ug/uL，则选择 20μL 洗脱液进行洗脱。