Nature | 人原肠胚的单细胞转录组学特征
原创 huacishu 图灵基因 2021-12-02 07:03
收录于话题#前沿生物大数据分析
撰文：huacishu
IF=49.960
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亮点：
1、作者分析了一个在自愿终止妊娠后被捐赠用于研究的人类胚胎，作者对胚胎中的细胞类型和这些细胞表达的基因进行了详细的描述，并与实验模型进行了对比；
2、虽然这里只研究了一个胚胎，但研究结果为其他模型系统的实验解读提供了新的背景。还为人类原肠胚形成这一此前未经探索的人类胚胎发育基本阶段提供了独特认知。
英国牛津大学的Shankar Srinivas教授课题组在国际知名期刊Nature在线发表题为“Single-cell transcriptomic characterization of a gastrulating human embryo”的论文。原肠胚形成是所有多细胞动物的基本过程，通过原肠胚形成，首先制定基本的身体发育计划。它在产生与空间协调的细胞多样性方面起着关键作用。对人类来说，原肠胚形成发生在受精后的第三周。然而人们对这一过程的了解相对有限，主要基于标本、实验模型或最近的体外培养样本。在这里，作者以空间分辨的方式描述了整个原肠胚形成的人类胚胎的单细胞转录产物，在受精后的16到19天之间进行分期。使用这些数据分析现有的细胞类型，并与其他模型系统进行比较。除了多能外胚层，还鉴定了原始生殖细胞、红细胞和各种中胚层和内胚层细胞类型。这种特性为解释其他模型系统中的实验提供了新的依据，对指导体外人类细胞定向分化具有重要的意义。
作者通过人类发育生物学资源从一位捐赠者那里获得了一个原肠胚阶段的人类胚胎，该捐赠者提供了知情同意书，用于研究因终止妊娠而产生的胚胎材料。样品完全完整，形态正常，包括带羊膜腔的胚胎盘，连接柄和卵黄囊与色素细胞（图1a）。显微解剖了卵黄囊和连接柄，分离出带有覆盖羊膜的胚胎盘。椎间盘的背侧和腹侧视图显示原始条纹沿长的吻侧-尾侧轴延伸约为椎间盘直径的一半（图1b）。在条纹的一端可以看到原始节点。为了在分离细胞进行单细胞RNA测序（scRNA seq）时保留解剖学信息，将胚胎分为卵黄囊和胚胎盘（图1d）。经过严格的质量筛选，生成了1195个单细胞库，平均每个细胞检测到4000个基因。所有细胞均显示Y染色体基因的表达，XIST转录本基本上无法检测到，证实没有母体细胞污染。所有的细胞周期阶段都可以检测到，这表明正常的细胞周期正在发生。样本的基因组完整性正常，已鉴定的细胞数量与其他人类转录组数据集的范围相同。这些分析，连同样本的核型分析（方法）和形态学（图1a，b），表明该样本是正常人原肠胚形成的代表。用无监督聚类法检测了11个不同的细胞群（图1c）。利用解剖位置和标记基因的组合，将它们注释为：外胚层、外胚层（羊膜/胚胎）、原始条纹、新生中胚层、轴向中胚层、新生中胚层、高级中胚层、胚外中胚层、内胚层、血内皮祖细胞（HEP）和成红细胞（图1c）。通过与小鼠和非人灵长类食蟹猴细胞类型的比较，该注释得到了验证。Smart seq协议可以区分转录异构体，并检测基因异构体的簇特异性表达。作者创建了一个web界面（http://www.human-gastrula.net），以交互方式探索这些数据，并作为用户友好的社区资源。
CS7外胚层簇的鉴定为从转录上定义子宫中存在的人类启动多能性状态提供了机会。为了产生体内启动和初始状态，首先将外胚层数据与现有的植入前人类胚胎scRNA序列数据结合起来，以捕获体内初始状态。细胞根据其发育阶段显示出有序的模式（图2a）。接下来，将未经处理和预处理的体外培养的人类ES细胞的转录组投射到这个表达上。结果发现原始人类ES细胞最接近胚胎细胞，而预处理的人类ES细胞部分与CS7外胚层重叠，这验证了在整体转录组水平上，人类ES细胞体外捕获的预处理状态与代表体内预处理状态密切相关。在体内和体外对原始状态和启动状态的比较显示出一些差异，这可能为进一步完善体外模型提供了建议。可以采用类似的方法来评估人原肠胚形成的体外模型。扩散图和RNA速度分析（图2b）显示了来自外胚层的轨迹，沿着与中胚层和内胚层相对应的第二扩散组分（DC2）分离。第一扩散组分（DC1）与细胞类型和空间位置密切相关，反映了细胞的分化程度和“年龄”，这取决于该样本过去从外胚层中出现的距离（图2b）。例如，在原肠胚形成过程中相对较早出现的胚外中胚层细胞比出现较晚的轴向中胚层细胞离外胚层更远。这表明，在这个阶段，这些簇还不代表特定的中胚层亚型。为了探索原肠胚形成过程中外胚层的变化，用属于外胚层、原始条纹、新生中胚层和外胚层（羊膜/胚胎）簇的细胞计算了RNA速度载体。这支持了从外胚层到中胚层，通过一侧的原始条纹到另一侧的外胚层的分叉的存在（图2c）。使用扩散时间对细胞进行排序提供了一种方法来推断外胚层细胞分化为外胚层或进入原始条纹并开始分层为新生中胚层时基因表达的变化（图2c）。虽然可以检测到羊膜和胚胎外胚层（DLX5、TFAP2A和GATA3）共有的标记物的强烈上调，但早期神经诱导标记物（SOX1、SOX3和PAX6）和分化神经元（TUBB3、OLIG2和NEUROD1）无法检测到或表达水平很低。特别是，无法检测到任何表达两种或两种以上标记SOX3、PAX6或TUBB3的细胞。总之，这些数据表明，在CS7胚胎中，神经分化尚未开始。小鼠是研究哺乳动物原肠胚形成的主要模型。为了公正地测试人和小鼠原肠胚形成的相似性和差异性，使用伪时间分析比较了人原肠胚从外胚层到新生中胚层的转变与小鼠原肠胚单细胞图谱中的等效群体。鉴定了这两个物种共有662个基因，它们在这一发育轨迹上差异表达。其中大多数（531人）在整个时间内具有相同的趋势，要么增加（117人），要么减少（414人）。例如，在小鼠和人类中，从外胚层过渡到新生中胚层期间，CDH1表达降低，TBXT瞬时表达，SNAI1持续增加（图2d）。此外，还发现了一些在两个物种中具有不同趋势的基因，如SNAI2（仅在人类中上调）、TDGF1（相反的趋势）、FGF8（仅在小鼠中瞬时表达）和FGF2（在人类中表达下调，但在小鼠中根本不表达）。为了在实验上验证这些人类特异性转录趋势，使用了一个基于人类ES细胞的体外模型，从表生细胞过渡到新生中胚层，并在人类ES细胞分化过程中发现了类似的趋势（图2e，f）。将这个比较扩展到包括食蟹猴原肠胚形成的最接近的阶段。对这三个物种的信号分子表达趋势的分析再次揭示了广泛的相似性，以及一些特定的差异。
外胚层（羊膜/胚胎）簇在神经板的吻侧边界表达胚胎外胚层共有的标记，这将产生表面外胚层和羊膜外胚层。为了进一步探索这个群体，进行了亚聚类，发现了两个亚群体，其中一个代表羊膜外胚层，由VTCN和GABRP的高表达表示（图3a）。另一个亚群（NNE）代表形成神经板的头端边界处的胚胎非神经外胚层或未成熟羊膜。起源于早期外胚层的关键细胞群是原始生殖细胞（PGC）。在小鼠中，PGC大约在E7.25出现。最近的研究表明，在非人类灵长类动物和离体培养的人类胚胎中，表达某些PGC标记的细胞可以在E11处被识别。与此一致，我们能够在原始条纹簇中检测到少量PGC（图3b）。通过比较早期人类PGC与小鼠和非人灵长类动物PGC的转录谱，确定了这些物种与其他不同物种（如DND1和PDPN）之间共享的标记（图3b）。内胚层簇显示了基于基因表达和细胞解剖起源的更高阶次结构。亚聚类显示了四个空间上不同的亚群：下胚层、卵黄囊（YS）内胚层和两个确定的内胚层（DE1和DE2）组（图3c）。这些细胞与E7.25小鼠内胚层亚型的比较证实了作者先前的解释（图3c）。两个确定的内胚层簇从尾部区域收集的细胞比例最大。它们之间的主要区别之一是细胞在细胞周期各个阶段的分布，其中DE1比DE2更具增殖性。DE2还显示前内胚层标记物HHEX、OTX2、SHISA2和CER1的表达增加。对转录亚型的分析还揭示了这些内胚层簇在标记物（如APOA2和TTR）上的进一步差异。
作者的初步分析显示有两个血液相关簇，即成红细胞和血液内皮祖细胞（HEP）。原始红细胞的鉴定与卵黄囊中的色素细胞和胚胎珠蛋白基因的表达一致（图4a）。这是出乎意料的，因为在小鼠胚胎的同等阶段缺乏色素血细胞（约E7.25）。XIST和Y染色体特异性基因的表达排除了这些细胞起源于母体的可能性。HEP的无监督聚类显示四个亚群具有不同的转录和亚型特征（图4b）。这些代表内皮细胞、巨核细胞红系祖细胞（MEP）（同时表达巨核细胞和红系标记物）、髓系祖细胞和红系髓系祖细胞（EMP）群体。扩散分析显示基于HEP亚型的轨迹分离（图4c）。血红蛋白化细胞和多个造血祖细胞群的存在表明，与同等阶段的小鼠胚胎相比，人类的造血进一步发展（E6.75–E7.5）。为了以无偏的方式检验这一点，将人类集群序列与小鼠原肠胚单细胞图谱中的等效群体进行了比较，该图谱跨越E6.5–E8.5。与分别对应于E7.0和E7.5小鼠细胞的人类外胚层和原始条纹相反，所有人类造血细胞群与小鼠E8.5期细胞最密切相关（图4d），进一步表明人类的造血比小鼠的同时期更为先进。
测序标本的独特性意味着在对子宫内人类原肠胚形成进行概括时必须小心。在这些早期阶段从伦理上获得的人类样本非常罕见，因此，在这种情况下，将人类原肠胚转录组与来自阶段匹配的非人灵长类动物的转录组进行比较将是有益的。目前，对这一人类样本的描述提供了一些保证，即它反映了正常发育的大体形态、核型、分布，其单细胞转录组与模式生物的原肠胚形成范例具有广泛一致性。在这一阶段的胚胎已经有PGC和红细胞。原肠胚细胞从外胚层向中胚层转化的分化轨迹和信号通路在人类和小鼠之间广泛保守，表明小鼠代表了人类原肠胚形成的良好模型。然而，一些显著的差异表明，EMT的过程可能在特定信号家族成员的水平上受到不同的调节。这些特定于人类的分化细节将是完善人类胚胎干细胞定向分化方法的宝贵资源。此外，他们还将帮助解释模型生物（如小鼠或体外原肠胚系统）的原肠胚形成实验结果。人和小鼠的原肠胚在形态上非常不同，人的原肠胚形成一个圆盘，而小鼠的原肠胚是圆柱形的。这种形态上的巨大差异改变了原肠胚形成过程中细胞的迁移路径，从而改变了细胞可能受到来自相邻生殖层的诱导信号。因此，将这一人类原肠胚单细胞转录组与具有类似胚胎盘的其他生物（如兔子、小鸡和非人灵长类）的阶段匹配原肠胚进行比较是很重要的。这将使人们能够解决人类和小鼠转录组之间的特定差异在多大程度上仅仅是进化差异的结果，或者是反映形态差异。
教授介绍
Shankar教授在印度Nizam学院获得理学学士学位。随后，他加入了纽约哥伦比亚大学，并在那里获得了分子遗传学博士学位。他开发了延时显微镜方法来研究早期植入后小鼠胚胎，利用该方法，他描述了内脏内胚层细胞的活跃迁移，这是胚胎前后轴正确定向所必需的过程。2016年，他成为发育生物学教授。Shankar小组的研究主要集中在两个领域。第一个是了解在原肠胚形成之前和期间形成早期哺乳动物胚胎的协调细胞运动是如何控制的。第二是了解心脏是如何形成和开始跳动的。Shankar的研究小组采用多学科协作的方法来解决这些问题，使用的技术包括分子遗传学、光片和共焦延时成像、单细胞方法、蛋白质组学和胚胎外植体培养。
参考文献
Tyser RCV, Mahammadov E, Nakanoh S, Vallier L, Scialdone A, Srinivas S.Single-cell transcriptomic characterization of a gastrulating human embryo.Nature. 2021;10.1038/s41586-021-04158-y. doi:10.1038/s41586-021-04158-y