RNA-seq常用命令（无参）

0.前期准备

01.raw_data        #用于存放原始数据
02.fastq           #用于存放fastq格式数据
03.fastqc          #用于存放QC结果
04.trinity_result  #用于存放trinity结果
数据处理的顺序：01.raw_data > 02.fastq > 03.fastqc > 04.trinity_result

1.下载SRA

先cd到01.raw_data目录下，执行以下命令（二选一）：

nohup axel -q ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByRun/sra/SRR/SRR130/SRR1300434/SRR1300434.sra &

axel是一种多线程下载工具，比wget快；-q参数能让axel进入静默模式（选用）。

nohup wget -c ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByRun/sra/SRR/SRR130/SRR1300434/SRR1300434.sra &

用wget的时候记得加-c参数，支持断点续传，就会方便很多。

用脚本批量下载数据的代码参考附录里的内容。

2.fastq-dump

  fastq-dump --defline-seq '@$sn[_$rn]/$ri' --split-files file.sra --split-3 -O|--outdir

这个是trinity给的命令，如果后面要用trinity进行无参组装的就需要加上--defline-seq '@$sn[_$rn]/$ri'这串看不懂的“乱码”，就要用这个命令，否则trinity会报错说无法识别这个格式。

经过改良后的命令：

nohup fastq-dump --defline-seq '@$sn[_$rn]/$ri' --split-3 file.sra -o ../02.fastq &

默认输出在上一层目录的02.fastq这个文件夹里。

-o：重定向输出结果的位置。将结果输出到上一级目录下的02.fastq文件夹内。

可选用的参数：

--gzip, --bzip2: 以压缩文件的方式输出结果。有利于减少文件的占用空间。

3.质控

不管什么数据，质控一下还是很有必要的，多看fastqc结果，即是积累经验，也是及时发现数据可能出现的问题。首先cd到../02.fastq，之后执行：

  fastqc -t 8 *.fq -o ../03.fastqc

-t: 使用的线程数。现在用的服务器是20 CPU 40线程，以后这个值可以改大一点(range from 1~40，但是一般取10，如果文件比较多可以取20。)

-o: 重定向输出结果的位置。放在03.fastqc里面。

用filezilla登陆服务器找到对应文件夹将生成的html文件下载到本地进行查看。如无问题则可进行下一步Trinity的操作，如有问题则进行质控部分余下的操作。

因为篇幅原因，将单独写一个关于如何查看fastqc结果的教程。敬请期待

需要去除接头的情况：

cutadapt

http://mp.weixin.qq.com/s/jZ37itt48slYrMNSvRxjNg

trimmomatic

https://www.jianshu.com/p/7b5591673255

需要对双端测序数据进行过滤低质量reads操作的情况：

sickle

https://mp.weixin.qq.com/s/ALY2FJCO10x02A7cy9qHyA

当你想改善你的数据的问题但是你又新入门啥软件都不会的时候（推荐使用）：

fastp

https://www.jianshu.com/p/fae5b3c11e74

  fastp -i name.fastq -o name.fastp.fastq  #单端
  fastp -i name_1.fastq -o name_1.fastp.fastq -I name_2.fastq -O name_2.fastp.fastq  #双端

4.Trinity

cd到../fastq文件夹后，执行以下命令：

双端测序命令：

nohup Trinity --seqType fq\fa --left ?  --right ?  --CPU 20 --max_memory 50G -output ../trinity_result/?.trinity &

left和right不能随意设置，left必须是_1，right必须是 _2.
一般type是fq
将?的位置用具体需要操作的文件名代入即可。

单端测序命令：

nohup Trinity --seqType fq\fa --single ?  --CPU 20 --max_memory 50G -output ../trinity_result/?.trinity &

ps：输出结果的名字里必须含有trinity这个关键词，否则无法正常运行。

5.TransDecoder

cd到../trinity_result/filename.trinity文件夹下后，找到一个叫做Trinity.fasta的文件，执行：

#step 1: 提取最长的开放阅读框
  TransDecoder.LongOrfs -t ./Trinity.fasta
  
  #step 2: (可选),BlastP搜索和Pfam搜索
    #BlastP搜索：蛋白库搜索， Swissprot (快) or Uniref90 (慢 but more comprehensive)
  blastp -query transdecoder_dir/longest_orfs.pep -db uniprot_sprot.fasta -max_target_seqs 1 -outfmt 6 -evalue 1e-5 -num_threads 10 > blastp.outfmt6
    #Pfam搜索：肽或蛋白域预测，需要安装hmmer3和Pfam数据库
  hmmscan --cpu 8 --domtblout pfam.domtblout /path/to/Pfam-A.hmm transdecoder_dir/longest_orfs.pep
  
  #step 3: 将Blast和Pfam搜索结果整合到编码区域选择这个步骤在尝试中发现比较费时间，建议用nohup命令进行操作。
  nohup TransDecoder.Predict -t target_transcripts.fasta --retain_pfam_hits pfam.domtblout --retain_blastp_hits blastp.outfmt6 &
  
  nohup TransDecoder.Predict -t trinity.fasta &  #简化版

通过TransDecoder这一步将能获得cds、pep、gff3、bed文件。用filezilla将以下五个文件拿到本地：

Trinity.fasta、
Trinity.fasta.transdecoder.cds、
Trinity.fasta.transdecoder.pep、
Trinity.fasta.transdecoder.gff、
Trinity.fasta.transdecoder.bed

将这几个文件以可分辨的名字进行命名（如改成SRR1300215.fasta等）。

6.出个统计报告

还是在本目录下，对Trnity.fasta文件进行操作：

  TrinityStats.pl trinity_out_dir/Trinity.fasta >> stat.txt

会生成一个统计报告，并将内容重定向到stat.txt这个文件中。这个文件也记得保存下来。

结果展示。

以SRR1300215为例：

  ################################
  ## Counts of transcripts, etc.
  ################################
  Total trinity 'genes':  1524
  Total trinity transcripts:  1793
  Percent GC: 54.43
  
  ########################################
  Stats based on ALL transcript contigs:
  ########################################
  
    Contig N10: 1008
    Contig N20: 757
    Contig N30: 597
    Contig N40: 487
    Contig N50: 397
  
    Median contig length: 291
    Average contig: 379.04
    Total assembled bases: 679625
  
  
  #####################################################
  ## Stats based on ONLY LONGEST ISOFORM per 'GENE':
  #####################################################
  
    Contig N10: 965
    Contig N20: 715
    Contig N30: 559
    Contig N40: 461
    Contig N50: 382
  
    Median contig length: 287
    Average contig: 369.46
    Total assembled bases: 563055

7.附录

批量下载sra文件的脚本模板(mac版本，仅供参考)

  # 在终端运行
  #用axel下载会快一些
  brew install axel
  for i in {56..62}
  do
  # 也可以用wget 下载
  axel ftp://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByStudy/sra/SRP/SRP075/SRP075747/SRR35899$i/SRR35899$i.sra
  done

批量处理fastq-dump的脚本模板：(从人家的教程里摘下来的，仅供参考)

  #!/usr/bin/env bash
  for i in {56..62}
  do
  fastq-dump --gzip --split-3 -O /Users/chengkai/Desktop/zhuanlu_files -A SRR35899${i}.sra
  done

8.参考来源

文章：

转录组入门二（mac版）：读文献下数据

Author：thinkando

https://www.jianshu.com/p/16f40be759c8
Fastq-dump: 一个神奇的软件

Author：hoptop

https://www.jianshu.com/p/a8d70b66794c
转录组入门三（mac 版）：了解fastqc测序数据

Author：thinkando

https://www.jianshu.com/p/1174a53abe7d
使用Trimmomatic过滤低质量序列

Author：To_2019_1_4

https://www.jianshu.com/p/7b5591673255
TRANSDECODER寻找和预测ORF

Author：冰冻三丈

https://www.cnblogs.com/shawn2018/p/8399042.html

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Author：陈俊浩 Hanschen

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